计算机筛选与体外验证揭示Queuine作为治疗胰腺癌的潜在MAP4K4抑制剂

本研究针对胰腺癌治疗中MAP4K4靶点抑制剂开发的迫切需求，通过分子对接、分子动力学模拟和MM-GBSA计算筛选天然化合物库，发现Queuine和Thiamine具有优于吉西他滨的结合特性。体外实验证实Queuine的IC50值（5.95μM）比吉西他滨（64.17μM）低近10倍，ELISA试验显示其更强的MAP4K4酶抑制能力，联合用药实验表明Queuine与吉西他滨具有协同效应，为胰腺癌治疗提供了新型天然药物候选方案。

　　

胰腺癌作为最具侵袭性的恶性肿瘤之一，其五年生存率不足10%，被称为"癌王"。这种疾病的治疗面临巨大挑战，主要由于早期诊断困难、易转移扩散以及对现有化疗药物的耐药性。目前临床一线用药吉西他滨(Gemcitabine)虽然被美国食品药品监督管理局(FDA)批准使用，但存在生物利用度低、需要高剂量给药以及严重的脱靶细胞毒性等问题。

MAP4K4（Mitogen-activated protein kinase kinase kinase 4，丝裂原活化蛋白激酶激酶激酶4）是近年来发现的重要治疗靶点。这种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶在胰腺肿瘤组织中过度表达，与疾病进展密切相关。研究表明MAP4KK4通过调控JNK信号通路，促进细胞增殖和转移，从而推动胰腺癌的发展。临床病理学证据显示，MAP4K4在约半数患者中过度表达，且与总体生存率差、肿瘤大小和转移显著相关。

针对这一临床需求，研究人员开展了计算机辅助药物发现研究，旨在从天然产物中寻找高效低毒的MAP4K4抑制剂。研究团队通过系统性计算生物学方法结合体外实验验证，发现了一种名为Queuine的天然化合物具有显著抑制MAP4K4的潜力。

研究采用多技术融合策略：首先通过分子对接对3,200种天然化合物进行虚拟筛选；接着利用分子动力学模拟分析蛋白-配体复合物的稳定性；采用MM-GBSA方法计算结合自由能；通过MTT法检测细胞毒性并计算IC₅₀值；使用ELISA技术定量评估MAP4K4酶抑制活性；最后开展联合给药实验评估协同效应。所有实验均使用PANC-1胰腺癌细胞系（源自人胰腺癌上皮细胞）进行验证。

虚拟筛选天然化合物库的分子对接研究

研究人员从DrugBank数据库获取3,200种天然来源代谢物和营养药物分子，通过LigPrep模块生成15,203个构象后进行分子对接分析。结果显示，Queuine和Thiamine与MAP4K4的结合能分别为-7.11和-8.76 kcal/mol，优于吉西他滨的-6.67 kcal/mol。对接研究表明，Queuine与MAP4K4活性位点通过氢键与Glu106和Cys108残基相互作用，而Thiamine除与Glu106和Cys108形成氢键外，还与Asp171产生氢键作用，并与Tyr36产生π-阳离子和π-π相互作用。

分子动力学模拟

100纳秒的分子动力学模拟显示，所有体系的均方根偏差(RMSD)均收敛在3.0?以内，表明系统达到平衡状态。未结合MAP4K4的RMSD小于2.0?，显示更高稳定性。Queuine与Val170、Cys108、Gln157和Asp171等残基通过水桥保持超过50%模拟时间的相互作用，而Thiamine仅与Tyr36保持约50%模拟时间的接触。模拟结束时，Queuine和Thiamine仍稳定结合在结合区域，而吉西他滨则出现扩散出结合位点的趋势。

MM-GBSA结合自由能计算

MM-GBSA计算显示，Queuine、Thiamine和吉西他滨的总结合自由能(△G_bind^total)分别为-50、-47和-18 kcal/mol，表明Queuine具有最强的结合亲和力。能量分解表明库仑力(△E_coulomb)、共价相互作用(△E_covalent)、溶剂化能(△E_solv^GB)和范德华力(△E_vdW)都对结合自由能产生重要贡献。

试剂对细胞活力的影响

MTT实验显示，Queuine在5μM浓度下使PANC-1细胞存活率显著降低至53%，而吉西他滨在25μM浓度下使存活率降至66%。Thiamine即使在高浓度(10,200μM)下也仅使细胞活力降低至80%。Queuine的IC₅₀值为5.95μM，比吉西他滨(64.17μM)低近10倍，表明其更强的细胞毒性作用。

MAP4K4酶活性的ELISA检测

ELISA分析表明，Queuine(0.5-6μM)和吉西他滨(5-60μM)均以剂量依赖方式降低MAP4K4酶活性。Queuine在所有浓度下均显示统计学显著差异(p<0.001)，而吉西他滨在30μM浓度下显著性开始降低。低浓度Queuine(0.5μM)的酶抑制效果是同等低浓度吉西他滨的四倍。

联合治疗研究

联合用药实验显示，0.25μM Queuine与0.05-0.1μM吉西他滨组合使细胞活力显著降低至84-86%。0.25μM Queuine与0.5-1.25μM吉西他滨组合使存活率进一步降低至65-66%。然而，当吉西他滨浓度增至2.5μM时，细胞活力反而回升至79%，表明存在竞争性抑制现象。1.25μM Queuine与0.05-0.1μM吉西他滨组合使细胞活力降至72-73%，而与更高浓度吉西他滨组合时同样出现效果减弱。

ELISA联合抑制实验证实，0.25μM Queuine与0.5μM吉西他滨组合显示最低的游离酶量，更高浓度的吉西他滨反而使抑制效果从协同转为抑制。

本研究通过整合计算生物学与实验验证方法，首次发现天然化合物Queuine作为高效MAP4K4抑制剂的潜力。研究表明Queuine不仅具有比临床用药吉西他滨更强的结合亲和力和酶抑制能力，还显示出显著的细胞毒性效应，其IC₅₀值比吉西他滨低近10倍。

更重要的是，研究发现Queuine与吉西他滨联合使用时可产生协同效应，尤其在低剂量组合下表现出更强的抗癌效果。这一发现具有重要意义，因为当前临床使用的吉西他滨与紫杉醇联合疗法虽然提高了治疗效果，但也带来了严重的周围神经病变等副作用。Queuine作为天然化合物，可能具有更好的安全性和耐受性。

该研究的创新点在于首次将Queuine鉴定为MAP4K4抑制剂，并系统验证了其体外活性和协同效应。研究结果不仅为胰腺癌治疗提供了新的候选药物，也为开发低剂量联合疗法提供了实验依据，有望减少现有化疗方案的毒副作用。

然而，研究也存在一定局限性。目前仅在细胞水平验证了Queuine的效果，尚未进行体内实验验证。此外，Queuine的具体抑制机制和药代动力学特性仍需进一步研究。研究人员建议后续开展动物实验来探索其治疗潜力，并深入研究其与吉西他滨协同作用的分子机制。

这项研究发表在《BMC Biotechnology》期刊上，为胰腺癌治疗领域提供了新的研究方向，展示了天然产物在抗癌药物开发中的重要价值，也为MAP4K4靶向治疗策略的发展奠定了坚实基础。