利用异源前肽增强超嗜热亚枯草蛋白酶在大肠杆菌中的表达：结构引导的策略与机制解析

本研究针对超嗜热亚枯草蛋白酶TKSP在大肠杆菌中表达时因前肽抑制不足导致细胞毒性高、产量低的问题，提出了一种创新的共表达策略。通过共表达来源于同源蛋白酶TKS的刚性前肽TKSpro，有效抑制TKSP的胞内自激活，使表达产量提升最高达10倍，并解析了TKSpro与TKSP的复合物晶体结构，揭示其通过C端疏水残基占据底物结合口袋的抑制机制。该研究为高效表达具有强细胞毒性的工业用蛋白酶提供了重要技术路径和理论依据。

　　

在当今的工业酶应用领域中，亚枯草蛋白酶（subtilase）因其广泛的底物特异性和在碱性条件下的高活性而成为洗涤剂、食品加工及医药合成等行业的关键用酶。特别是来源于超嗜热古菌的亚枯草蛋白酶，例如Thermococcus kodakarensis所产生的TKSP，不仅具有极端热稳定性，还能在表面活性剂存在下有效降解致病性朊蛋白（PrP^Sc），这为医疗器械的消毒及污染处理提供了新的生物解决路径。

然而，这类酶在大肠杆菌系统中进行异源表达时却面临巨大挑战：虽然TKSP能以可溶形式表达，但其前肽（TKSPpro）抑制能力不足，无法有效阻止酶在胞内的提前自激活，从而导致宿主蛋白被降解、细胞生长受阻，最终严重限制产量。以往研究表明，同源蛋白酶TKS的前肽（TKSpro）具有较高的结构刚性，即便在高温下仍能保持折叠状态并与催化结构域紧密结合，这为抑制TKSP活性提供了新思路。

为此，日本立命馆大学和京都府立大学的研究团队开展了一项联合研究，通过共表达TKSpro与TKSP，显著提高了TKSP在大肠杆菌中的表达水平，并借助晶体结构分析与分子突变验证，深入揭示了TKSpro对TKSP的抑制机制。该研究成果近期发表于《AMB Express》，为工业用蛋白酶的高效生产提供了新的解决方案。

本研究主要采用的关键技术方法包括：使用pET25b和pCDF1b载体在大肠杆菌C43(DE3)中共表达TKSP前体与TKSpro；通过热处理和离子交换层析纯化蛋白复合物；利用X射线晶体学解析TKSP_114?539(S359A)与TKSpro的复合物结构（分辨率为3.2 ?）；以N-succinyl-Ala-Ala-Pro-Phe-p-nitroanilide (Suc-AAPF-pNA)为底物测定蛋白酶活性；并通过点突变构建TKSpro变体（L69A、L69W、G56E），分析其抑制常数与表达产量的关系。

Co-expression of TKSpro enhances mature TKSP yield in E.coli

研究人员发现，单独表达TKSP前体（TKSP_1–640）时，大肠杆菌BL21(DE3)和Rosetta 2(DE3)均出现严重的生长缺陷，而催化失活突变体（S359A）则无此现象，表明TKSP的蛋白酶活性是细胞毒性的主要原因。转而使用耐受性菌株C43(DE3）进行共表达实验，结果显示TKSpro的引入明显恢复了细胞生长，并提高了TKSP的表达水平。经热激活处理后，共表达系统的蛋白酶活性比单独表达TKSP提高了5~10倍，最终从1 L培养液中纯化得到2.7 mg成熟TKSP。

TKSpro binds tightly to mature TKSP in a substrate-like manner

为进一步探究分子机制，研究团队解析了TKSP_114–539(S359A)与TKSpro的复合物晶体结构。结构分析表明，TKSpro以底物类似的方式结合在TKSP的活性中心裂隙，其C端四残基（Ala66?Leu69）完全占据TKSP的底物结合口袋（S1–S4亚位点），同时其中部β-转角环（Phe33?Pro37）通过疏水作用和氢键与TKSP的αβα亚结构互作。这种结合模式与TKSP自身前肽的结合方式相似，但TKSpro的Leu69在空间更大的S1口袋中具有更优的适应性，这可能是其抑制效果更强的原因。

Binding of hydrophobic residues at the S1 subsite is essential for TKSP inhibition

点突变实验显示，TKSpro的C端疏水残基Leu69对抑制能力具有关键影响：将其突变为色氨酸（L69W）后抑制常数K_i降至7.8 nM，优于野生型的16 nM；而突变为丙氨酸（L69A）后抑制能力显著下降（K_i = 62 nM）。在共表达实验中，TKSpro(L69W)仍能有效支持TKSP的高表达，而TKSpro(L69A)则导致表达活性下降四倍，说明疏水残基在S1口袋的占据对于抑制活性及表达增强均至关重要。

本研究通过共表达策略成功实现超嗜热蛋白酶TKSP在大肠杆菌中的高效生产，并从结构生物学和酶学角度阐明TKSpro的抑制机制。结果表明，利用刚性高、亲和力强的外源前肽（如TKSpro）能够有效抑制胞内蛋白酶活性，减轻细胞毒性，从而提高表达产量。这一策略克服了传统使用天然前肽时因稳定性不足导致的抑制失效问题，为其他细胞毒性蛋白酶的表达提供了普适性方法。此外，该研究强调前肽的C端疏水残基与β-转角环在抑制特异性中的重要作用，为后续前肽工程和蛋白酶生产体系的优化奠定了理论基础。

综上所述，该研究不仅提供了一种提升工业酶产量的有效方法，也为古菌来源蛋白酶的应用开发和机制研究提供了重要借鉴。