噬菌体受体结合蛋白与Fc片段融合增强小肠结肠炎耶尔森菌的吞噬作用

本研究针对抗生素耐药性细菌感染治疗难题，创新性地将噬菌体尾部纤维蛋白TFPgp17与IgG1 Fc片段融合，构建了双特异性蛋白Fc_TFPgp17。实验证明该蛋白能特异性识别耶尔森菌O:3血清型，并通过Fc片段介导巨噬细胞和中性粒细胞吞噬，显著提升病原菌清除效率。该研究为开发新型抗体样抗菌疗法提供了重要策略。

　　

在抗生素耐药性危机日益严重的今天，科学家们正在寻找对抗细菌感染的全新武器。耶尔森菌病作为一种人畜共患的食源性疾病，由小肠结肠炎耶尔森菌(Yersinia enterocolitica)和假结核耶尔森菌(Yersinia pseudotuberculosis)引起，其主要传染源为猪肉制品。根据2022年欧盟流行病学报告，耶尔森菌病已成为欧盟/欧洲经济区第四大常见胃肠道感染病，每年报告病例超过8000例，实际感染人数可能更高。

传统抗生素疗法面临严峻挑战，而单克隆抗体(mAbs)在癌症、自身免疫性疾病和病毒治疗领域的成功，为抗菌治疗提供了新思路。然而，针对细菌感染的抗体开发仍处于起步阶段，过去几十年间虽有40种单克隆抗体获得FDA批准，却没有一种用于细菌感染。失败案例包括针对金黄色葡萄球菌的tefimazumab和针对铜绿假单胞菌的KB001-A，这些失败让科学家意识到需要创新策略。

细菌表面碳水化合物靶点具有高度异质性，使得传统抗体开发困难重重。这时，自然界中完美的靶向工具——噬菌体受体结合蛋白(RBPs)进入了科学家视野。这些位于噬菌体尾部的蛋白质能够精准识别细菌表面受体，如脂多糖(LPS)、孔蛋白、磷壁酸等结构。特别值得注意的是，噬菌体RBPs的C末端片段与抗体可变区具有高度结构相似性，都专门负责特异性识别功能。

Karolina Filik-Matyjaszczyk团队基于前期研究发现，来自φYeO3-12噬菌体的尾部纤维蛋白gp17(TFPgp17)对耶尔森菌O:3血清型具有高度特异性识别能力。本研究创新性地将TFPgp17与IgG1免疫球蛋白Fc片段融合，构建了双特异性蛋白Fc_TFPgp17，使其既能通过RBP结构域识别细菌，又能通过Fc片段结合吞噬细胞，模拟抗体功能增强病原菌的清除。

研究人员采用了几项关键技术方法：使用CHO哺乳动物表达系统生产重组蛋白并通过三步纯化流程；通过PNGase F酶切去除N-糖基化；采用ELISA和流式细胞术验证蛋白结合特性；利用pHrodo Green染料标记细菌进行吞噬作用流式分析；通过庆大霉素保护试验(GPA)评估细胞内细菌存活率；使用商品化ELISA试剂盒检测细胞因子水平。实验使用了THP-1单核细胞系分化的巨噬细胞和HL-60早幼粒细胞系分化的中性粒细胞样细胞，以及耶尔森菌6471/76-c菌株(O:3血清型)。

Fc_TFPgp17与细菌和吞噬细胞的结合特性

研究首先通过ELISA实验证实了Fc_TFPgp17能够特异性结合耶尔森菌6471/76-c菌株。有趣的是，研究发现糖基化状态显著影响结合效率——通过PNGase F去除N-糖基化后，蛋白与细菌的结合能力明显增强。生物信息学分析显示TFPgp17序列中存在多个潜在的N-糖基化位点，这些位点在CHO表达系统中被糖基化后可能阻碍了与细菌受体的结合。

流式细胞术分析进一步证实Fc_TFPgp17能够通过其Fc片段与THP-1衍生的巨噬细胞和HL-60衍生的中性粒细胞结合。虽然未能获得完整的结合曲线，但实验明确证明了这种双特异性蛋白能够同时与细菌和吞噬细胞结合，具备了作为桥梁分子连接病原体与免疫细胞的基本特性。

Fc_TFPgp17增强吞噬作用

研究通过流式细胞术使用pHrodo Green染料评估吞噬效率，该染料只在酸性环境(如吞噬溶酶体)中发出荧光，从而特异性标记被吞噬的细菌。实验结果令人振奋：与未处理对照组相比，用1.5μM Fc_TFPgp17调理的细菌被THP-1巨噬细胞吞噬的数量增加了约两倍。在HL-60中性粒细胞中也观察到类似趋势，尽管效果略弱。

Fc_TFPgp17降低细胞内细菌存活率

庆大霉素保护试验(GPA)结果更为惊人。耶尔森菌通常能够在巨噬细胞内生存甚至繁殖，但使用Fc_TFPgp17调理后，细胞内存活细菌数量显著减少。在THP-1巨噬细胞中，30分钟、1小时和3小时时间点都观察到统计学显著差异；在HL-60中性粒细胞中效果虽然较弱但同样显著。这表明Fc_TFPgp17不仅促进了细菌被吞噬的过程，还增强了细胞内杀菌机制。

细胞因子反应增强

研究还检测了两种关键细胞因子：促炎因子TNF-α和抗炎因子IL-10。结果显示，用Fc_TFPgp17调理的细菌被吞噬后，TNF-α水平在三个时间点均显著高于未调理组。IL-10水平在3小时时间点也显示升高趋势。这表明Fc_TFPgp17不仅增强了吞噬作用，还促进了免疫细胞的激活和调节，可能通过Fc片段与Fcγ受体的相互作用引发了更强的免疫信号传导。

本研究成功证明Fc_TFPgp17作为一种双特异性蛋白，能够有效介导耶尔森菌O:3的识别和清除。其独特的设计结合了噬菌体RBP的高特异性与抗体Fc片段的免疫效应功能，为对抗抗生素耐药菌感染提供了新思路。

讨论部分指出，虽然糖基化影响了蛋白与细菌的结合效率，但这提示了进一步的优化方向——或许在原核系统中表达非糖基化版本，或对Fc片段进行定点突变以保持其与Fcγ受体的结合能力。Fc_control组显示的与细菌的非特异性结合也值得关注，可能由于耶尔森菌表达的Fc结合蛋白所致，这反映了病原体免疫逃逸机制的复杂性。

该研究的重大意义在于开辟了"抗体样抗菌疗法"的新途径。与传统抗体相比，噬菌体RBP具有演化优化的高亲和力和特异性，特别是针对难以靶向的细菌表面碳水化合物结构。这种方法不仅可用于治疗，还可能用于预防和诊断，且特异性高不会破坏正常菌群。

研究人员强调，虽然目前研究还处于早期阶段，但结果足够令人鼓舞，值得进一步探索。接下来的研究将验证原代细胞和动物模型中的效果，并可能扩展至其他病原菌-噬菌体系统。随着抗生素耐药性问题日益严峻，这种创新性治疗策略有望成为应对危机的重要武器之一。

该论文发表于《AMB Express》，展示了基础研究与转化医学的完美结合，为应对全球健康威胁提供了有希望的新方案。