真菌群落动态与理化特性关联：浓香型大曲发酵与储存过程中的高通量分析

本刊推荐：为解决浓香型大曲质量稳定性控制难题，研究人员开展其发酵与储存过程中真菌群落动态演替及理化特性关联研究。通过高通量测序技术揭示Clavispora、Wickerhamomyces等8个优势属的演替规律，发现糖化力与Rhizopus等6个属、液化力与Millerozyma等4个属显著相关（P<0.05），阐明微生物群落与酶活性的内在联系，为标准化生产提供理论依据。

　　

在中国白酒的酿造体系中，浓香型大曲（Strong-flavor Daqu, SFD）作为关键糖化发酵剂，其质量稳定性直接决定着白酒的风味品质与生产一致性。这种以小麦为原料，经过机械粉碎、加水拌料、压制成型、固态发酵和陈化储存的传统发酵制剂，在长达28天的发酵过程中需经历前缓、中挺、后缓落三个温度阶段，并在后续3-6个月的储存中完成微生物群落结构的稳定化。然而，由于大曲采用开放式接种工艺，其微生物群落来源于原料、环境及工艺过程的复杂引入，导致不同批次、不同产区的大曲质量存在显著差异。更关键的是，对于发酵与储存过程中真菌群落的动态演替规律及其与糖化力、液化力、发酵力、酯化力等关键理化指标的关联机制，迄今缺乏系统性的研究。

为解决这一行业共性技术难题，Chaohua等人在《AMB Express》发表了最新研究成果，通过采集四川宜宾两个相邻浓香型白酒厂的样本，运用高通量测序技术首次系统揭示了浓香型大曲发酵与储存全周期的真菌群落演变规律，并成功解析了微生物功能与理化特性的内在联系。

研究人员采用PacBio Sequel II平台对ITS1区进行全长测序，通过SMRT Link工具生成CCS序列，经Cut-adapt去接头和UCHIME去嵌合体处理，最终获得834,104条高质量序列。使用Usearch在97%相似度下聚类OTU，通过QIIME进行物种注释，并采用R语言pheatmap包绘制聚类热图。运用Mantel检验分析真菌群落与酶活性的相关性，通过FUNGuild进行功能预测，并基于Spearman相关系数（r>0.1, P<0.05）构建真菌共现网络。理化指标检测严格遵循QB/T 4257-2011标准，包括糖化力（35°C pH4.6条件下1g大曲1小时产生葡萄糖毫克数）、液化力（每克干曲液化淀粉克数）、发酵力（0.5g大曲30°C 72小时产生CO?量）和酯化力（25g大曲35°C 7天催化生成乙酸乙酯量）。

真菌多样性分析显示群落结构稳定性

通过稀释曲线、Shannon指数曲线和Rank丰度曲线证实测序深度充分（图2A-C）。Alpha多样性分析显示N1与N2样本在Chao1、Shannon、Simpson和Ace指数上无显著差异（图2D-G），表明不同产区大曲真菌群落结构具有高度相似性。Beta多样性的PCoA和NMDS分析则揭示出温度峰值前、储存期和3-4月储存后样本间的显著差异（图2H-I），证明发酵阶段和储存时间是驱动真菌群落结构演变的关键因素。

真菌群落结构呈现动态演替规律

从75个门、663个属中鉴定出8个优势属：Clavispora、Wickerhamomyces、Dipodascus、Thermomyces、Candida、Geotrichum、Aspergillus和Thermoascus。门水平上Ascomycota（子囊菌门）和Basidiomycota（担子菌门）为绝对优势门类，且在发酵与储存期间呈现显著动态变化（图3A）。属水平分析发现Thermoascus在储存期间逐渐减少，Geotrichum在N1中先升后降，Aspergillus在N2中先降后升，而Thermomyces仅在N2温度峰值后检出且随储存减少（图3B）。值得注意的是，温度峰值前Candida在N2中占比超过70%，Dipodascus在N1储存期间呈先升后降趋势，Wickerhamomyces在N2储存4个月后显著增加。

理化指标与酶活性呈现关联特征

温度监测显示两个厂区大曲均在第7天达到峰值温度（≥60°C）并维持6天（图4A），但N1降温较N2更缓慢。水分变化趋势基本一致（图4B）。酶活性分析揭示糖化力在温度峰值前最高（N1:454.20 U·g^-1），随发酵进程下降但在储存期回升，3个月时达351.30 U·g^-1（图4D）。液化力和发酵力在发酵期间持续下降（图4C,F），酯化力虽总体下降但N1在储存3个月时达到峰值874.01 U·g^-1，N2则在1个月时最高（1001.10 U·g^-1）（图4E），表明不同批次大曲在储存期间存在理化特性分化。

真菌-酶活性关联网络揭示功能机制

Mantel检验发现糖化力与Rhizopus（r=0.364, P=0.048）、Blastobotrys（r=0.445, P=0.023）、unclassified_Sordariales（r=0.446, P=0.024）、Aureobasidium（r=0.415, P=0.035）、Plectosphaerella（r=0.318, P=0.016）等6个属显著正相关；液化力与Millerozyma（r=0.400, P=0.042）、Lichtheimia（r=0.421, P=0.031）、Blastobotrys（r=0.414, P=0.034）等4个属显著相关（图5C）。共现网络分析显示41个节点和92条边中正相关性占83.7%，Ascomycota（29属）和Basidiomycota（10属）为主导门类（图5A）。功能预测将32个属划分为Pathotroph（病原营养）、Saprotroph（腐生营养）和Symbiotroph（共生营养）三种营养模式，其中Thermoascus具97.94%腐生营养特性，Trichosporon具68.78%病原营养特性（图5B）。

本研究通过多维度分析揭示了浓香型大曲发酵与储存过程中真菌群落的动态演替规律及其与关键酶活性的内在联系。研究发现糖化力和液化力的变化与特定真菌属存在显著相关性，其中Rhizopus、Aureobasidium等属通过产生淀粉酶、蛋白酶和脂酶等胞外酶，直接参与底物降解和风味前体形成。共现网络分析进一步揭示了Thermomyces、Geotrichum、Thermoascus等核心类群在维持群落结构稳定性中的关键作用，正负相关性交织的复杂网络关系增强了微生物群落对环境波动的抵抗能力，保障了大曲发酵过程的稳定性。

该研究的创新性在于首次系统解析了不同产区浓香型大曲真核微生物群落与多功能酶系的关联机制，为理解传统发酵制剂中微生物生态功能提供了新的视角。研究成果不仅为浓香型大曲的质量标准化控制提供了理论依据和关键技术参数，也为人工构建功能性微生物群落、开发定向强化大曲提供了科学基础。未来研究需扩大采样范围覆盖更多产区和时间点，并进一步聚焦关键真菌的功能验证及其协同作用机制，最终实现传统发酵食品的精准调控与品质提升。