心脏FFPE组织蛋白质组学突破：揭示区域特化与疾病机制的新视野

本研究针对心脏组织难以获取的瓶颈，开发了基于福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）心脏标本的高通量蛋白质组学分析技术。通过对窦房结区域和致心律失常性心肌病（ACM）患者心肌活检的深度蛋白质组分析，研究人员成功量化了约4,000种蛋白质，揭示了区域特异性蛋白特征（如胶原VI和G蛋白偶联受体信号富集）和疾病特异性蛋白谱（纤维化和代谢/细胞骨架紊乱）。该研究为利用临床存档样本进行大规模回顾性研究提供了可靠方法，推动了精准心脏病学的发展。

　　

心血管疾病的研究在过去二十年中取得了显著进展，这主要得益于组学技术的快速发展。虽然基因组学已经改变了临床研究和诊断方式，但要系统阐明功能后果及其相关性，还需要额外的分子方法。此外，研究由终身暴露于环境和生活方式风险因素累积效应引起的疾病，也需要互补的方法。蛋白质组学研究代表了一种强大的策略，可以评估遗传变异以及外部因素的综合影响，从而揭示多因素疾病（如心血管疾病）的复杂遗传基础。

然而，将这种进步转化为心血管疾病仍然具有挑战性，部分原因是难以获取心脏组织进行大规模疾病特异性分子谱研究。在临床环境中，用于诊断目的的心脏标本通常保存为福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）组织样本。几十年来，此类心脏FFPE样本能够进行详细的组织病理学分析，构成了诊断和预后评估的支柱。医院病理科保存的FFPE心脏标本档案因此代表了宝贵的资源，克服了大型队列研究中组织获取的障碍，使得能够对不同（亚组）心脏病患者进行分子分析。

基于质谱的蛋白质组学已成为深度和无偏定量研究蛋白质组的首选方法。虽然FFPE样本的蛋白质组学研究在肿瘤学等领域取得了进展，量化了数千种蛋白质，但类似的工作在心脏病学中显著滞后。先前对人类心脏蛋白质组的研究基本上局限于新鲜冷冻（FF）组织样本、浅层蛋白质覆盖或基于细胞系的研究。受到其他领域最新进展的启发，本研究旨在评估类似策略是否能够表征人类心脏FFPE样本的蛋白质组。

福尔马林固定通过广泛的蛋白质交联来保存组织，这使后续的蛋白质组分析变得复杂。本研究的一个关键目标是评估来自FF与FFPE心脏组织样本的蛋白质组数据的可比性。通过量化福尔马林固定引入的变异相对于生物和技术来源的变异，本研究确立了心脏FFPE组织用于定量蛋白质组学的可靠性。研究人员提出了两个案例研究来说明这种方法在研究人类心脏样本方面的潜力，这些样本在诊断背景下收集并作为FFPE保存样本存储在医院档案中。首先，展示了心脏组织中空间相关的蛋白质组图谱，解决了区域特化问题。其次，将该方法应用于致心律失常性心肌病（ACM）患者的疾病分析，例示了蛋白质组学驱动的疾病表征。

本研究采用了多种关键技术方法。研究人员利用高效的去污剂和疏水性污染物去除、板式样本处理、下一代质谱技术和先进的计算工具，对FFPE心脏组织进行了深入的蛋白质组分析。样本来源于人类左心室组织、存档的含窦房结的人类心脏组织以及回顾性临床队列的心肌活检（包括ACM患者和供体心脏）。蛋白质提取后，通过酶解消化，使用串联质量标签（TMT）进行相对定量或采用数据非依赖采集（DIA）策略。质谱测量在高分辨率液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）系统上进行，数据通过FragPipe和DIA-NN等平台进行处理和分析。

Preserved cardiac proteome profiles are retrieved from FFPE heart tissue samples

为了评估从人类心脏FFPE生物样本中进行深度定量蛋白质组分析的可行性，研究人员设计了一项对照研究，以确定心脏蛋白质组是否被保存并可以从这些样本中检索。他们直接比较了来自人类心脏组织的蛋白质组谱，这些组织要么是FF保存，要么是FFPE保存。左心室组织取自五个人类心脏，每个样本分成两部分：一部分快速冷冻，另一部分福尔马林固定和石蜡包埋。为了评估处理步骤的影响，研究人员通过三种不同的方法进行蛋白质提取。提取的蛋白质被酶解，产生的肽段使用串联质量标签（TMT）在所有样本中进行相对定量。为了最大化蛋白质组覆盖，研究人员在高pH值下进行分级，以减少样本复杂性，然后进行高分辨率液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）测量。研究人员测量了24个级分，总共识别了5,915种蛋白质、57,330个肽段和218,400个肽段谱匹配（PSMs）。其中，5,697种独特蛋白质基于MS/MS谱中的样本特异性报告离子进行定量。值得注意的是，5,652种蛋白质在没有缺失值的情况下被定量，实现了超过99%的数据完整性。与先前使用类似方法的努力相比，本研究识别了2.3倍的PSMs、1.5倍的肽段和1.2倍的蛋白质。尽管心脏蛋白质组存在固有的动态范围挑战，其中一小部分蛋白质对整体信号贡献不成比例，但每种蛋白质平均由18个PSMs定量，这为获得的相对蛋白质定量提供了信心。

测量的蛋白质强度的层次聚类将样本按照评估的三种实验条件分组，显示使用相同工作流程处理的FFPE和FF样本彼此之间比与使用参考工作流程处理的FF样本更相似。所有样本的蛋白质强度测量显示出极好的重现性（R > 0.94），使用相同工作流程处理的FFPE和FF样本显示出特别高的相关性（R = 0.99）。主成分分析（PCA）表明，变异的主要来源是组织处理工作流程而不是保存策略。受到蛋白质提取中 noted 差异的启发，研究人员评估了导致这种差异的蛋白质中的偏差。第一主成分（PC1）负载的基因集富集分析（GSEA）显示，在参考FF样本中，膜封闭细胞器蛋白质以及其他质膜蛋白质富集。与心脏细胞表面蛋白质图谱的交叉支持膜蛋白质显著促进了这种分离。这表明，虽然相对蛋白质定量在给定条件下的所有重复中是一致的，但从FFPE样本中检索来自特化区室（如质膜）的蛋白质更具挑战性。研究人员强调第二主成分（PC2）捕获了个体之间的生物学差异（1+2+3 versus 4+5），这鼓励我们进一步探索数据集中的变异来源。变异分解分析显示，样本处理工作流程占蛋白质组范围变异的中位数为28.9%，其次是受试者差异为10.6%，而样本的福尔马林固定贡献最小，仅为1.1%。这些结果支持该方法能够以固定的最小影响捕获个体间差异。

最后，为了评估我们从心脏蛋白质组和工作流程重现性中捕获个体间差异的能力，研究人员从五个石蜡包埋心脏中的每一个收集了三个切片。随后的TMT多重蛋白质组分析实验基于80,523个PSMs，量化了4,998种独特蛋白质，没有任何缺失值（与先前测量有91%重叠）。对获得的数据集进行偏最小二乘判别分析有效区分了个体样本的生物学测量，每个个体的三个重复紧密聚类。这些结果证实了可以从FFPE样本中获得一致的、样本特异性的心脏蛋白质组谱。

Scaling throughput of cardiac proteome profiling with label-free data-independent acquisition

心脏FFPE样本蛋白质组分析的一个重要前景是其在分析回顾性临床队列组织方面的潜力。如前一节所述，与TMT多重结合使用的蛋白质组数据的数据依赖采集（DDA）在大型研究中存在局限性，因为它依赖于采样最丰富的肽段，通常导致缺失值并影响多个样本的数据完整性。相比之下，数据非依赖采集（DIA）最小化缺失值，使其特别适用于大型研究。为了评估心脏FFPE蛋白质组分析的可扩展性，研究人员对五个人类心脏中的每一个进行了四个独立FFPE切片的单次DIA测量。样本在 trapped ion mobility spectrometry-time of flight (timsTOF HT) 质谱仪上以 dia-PASEF（并行累积-串行碎裂）模式进行分析，使用两种不同的分析梯度：45分钟（每天约30个样本的通量）和101分钟（每天约15个样本的通量）。这总共生成了40个独立LC-MS运行的数据。在数据处理中，研究人员评估了两种不同的方法：使用样本特异性光谱库（从分级样本池的DDA测量生成）或计算机预测（无库）方法。

使用较短的45分钟梯度，研究人员通过计算机无库分析方法识别了33,051个肽段前体，映射到3,277个蛋白质组，该方法使用基于深度学习的保留时间、离子迁移率和强度预测进行评分。使用较长的101分钟梯度和相同的数据处理策略，研究人员识别了41,357个前体，对应3,921种蛋白质，代表了蛋白质识别的10%改进。评估收集项目特异性光谱库的优势，该库从离线分级样本池生成，包含59,079个前体和4,755种蛋白质，研究人员观察到使用101分钟梯度的最佳性能，识别了3,729种蛋白质（36,863个前体），使用较短梯度识别了3,577种蛋白质（34,596个前体）。两种不同LC梯度在不同库分析下的蛋白质识别重叠总结在扩展数据图中，显示2,899种蛋白质被一致测量。总体而言，长梯度方法的无库分析产生了最多的前体和最高的蛋白质覆盖。

测量的蛋白质强度的PCA显示，所有四种测试条件都能有效区分五个个体的蛋白质组谱。尽管分析深度存在变异，长和短梯度都实现了同样明显的样本分离。对于两种梯度长度，使用项目特异性库或计算机库的数据处理导致了测量的蛋白质数量的不同聚类模式，具有相似程度的解释变异。这表明我们捕获了反映各自个体的稳健生物学信号，独立于分析策略。为了进一步评估测量一致性，研究人员分析了单个蛋白质强度的变异系数（CV）并对重复样本进行了层次聚类。这些分析显示技术变异性一致较低，中位CV为11%，表明跨重复测量的高重现性和定量精度。

为了验证使用DIA测量策略获得的FFPE心脏蛋白质组谱与FF组织的一致，研究人员使用长DIA方法和无库搜索策略对相同五个个体的匹配FF组织样本进行了额外测量。FF样本蛋白质强度的PCA密切镜像了FFPE数据集中观察到的分离。值得注意的是，前两个主成分在两个数据集中都占了总变异的60%以上，并清楚区分了五个个体，强调了个体间蛋白质组差异 regardless of tissue preservation method。通过CV评估的定量精度也可比，跨重复的中位CV为12%，与FFPE样本匹配。

研究人员进一步根据沿PC1的分离将样本分层为两个患者簇，并比较了这些组之间在FF和FFPE数据集内的差异蛋白质丰度。显著调节蛋白质的折叠变化强烈相关（FFPE显著Pearson R=0.86，FF显著R=0.84，两者都显著蛋白质R=0.92），显示丰度变化在保存方法之间可靠镜像。对通过DIA和TMT测量的FFPE样本的可比分析也揭示了高度一致性（R=0.84-0.93），证实了跨工作流程和组织类型的蛋白质组特征的稳健性。

研究人员显示，心脏蛋白质组谱的DIA测量提供了基于TMT方法的合适替代，提供了高分析精度，尽管在测量深度上有些权衡。研究结果表明，关键蛋白质组特征可以使用当前基于深度学习的无库搜索策略稳健捕获，支持其与传统库依赖方法一起的实用性，特别是在样本可用性有限的研究中。研究人员进一步显示，梯度长度可以有效缩短以减少测量时间，同时保留样本队列的生物学特征。

Image-guided proteomics of the human sinoatrial node reveals molecular heterogeneity

从FFPE心脏标本解析心脏蛋白质组谱的能力对于研究心脏亚结构和通过组织病理学分析识别的特定区域具有重要前景。为了展示我们方法研究需要组织学图像数据以进行精确识别和靶向样本收集的亚结构的能力，研究人员将我们的FFPE-DIA工作流程应用于包含窦房结（SAN）的存档人类心脏组织。SAN具有其独特的分子组成和复杂的形态，对研究提出了重大挑战。研究人员从四个人类心脏获取了包含SAN的存档心脏组织，并对SAN与相邻右心房（RA）组织进行了无偏蛋白质组分析。SAN使用苏木精和伊红（H&E）染色切片定位，这指导了从SAN内和相邻RA心肌的样本解剖。 following tissue homogenization and protein digestion,研究人员进行了无标记DIA-MS测量，使用无库数据处理方法量化了每个样本中约4,000种独特蛋白质。在我们队列中总共识别的4,249种蛋白质中，122种专门在SAN或RA中发现；其中包括三种已知的SAN标志物：HCN4、PDE1A和IGSF9B。跨样本蛋白质测量的稳健覆盖导致最小缺失值。这，结合测量的蛋白质强度的高Pearson相关系数（子结构内平均R=0.91）和按心脏区域（SAN versus RA）的样本聚类，为定量比较提供了优秀基础。蛋白质强度的PCA证实了层次聚类结果，数据中的主要变异来源归因于空间差异，如SAN和RA样本沿PC1的明显分离所证明。PC2捕获了个体间差异作为数据集中整体变异的第二大贡献者。变异分区分析观察到类似趋势。

为了确定从SAN和RA测量的蛋白质组是否捕获了这些区域之间 well-established 细胞差异，研究人员利用了最近发布的人类心脏传导系统单细胞转录组学数据。使用去卷积方法，研究人员估计了细胞类型标记在SAN与RA中相对丰度的相对富集。分析显示SAN内成纤维细胞和壁细胞标记富集，而心房心肌细胞标记主要在RA中表达。这一发现与起搏细胞存在于富含成纤维细胞的微环境中， enriched in mural cells（平滑肌细胞和神经细胞）的理解一致。进一步支持这些结果，功能富集分析突出了SAN和RA中特定细胞成分的富集。SAN表现出细胞外基质（ECM）、质膜和囊泡蛋白质的富集，而RA以肌浆和线粒体蛋白质的富集为特征。这些功能富集与细胞类型去卷积分析一致，强调了SAN中成纤维细胞和壁细胞（周细胞）的突出，以及淋巴细胞和神经细胞。支持这些结果，功能富集分析突出了SAN和RA中特定细胞成分的富集。火山图显示SAN特异性标志物（HCN4、PDE1A和TNNI1）在SAN中显著上调（Benjamini-Hochberg调整P<0.05，|logFC|>1）。VSNL1，一个最近提出的SAN标志物，显著更丰富，尽管其折叠变化低于设定阈值。相比之下， established RA标志物如MYL7和MYH6在RA中显著更丰富。研究人员进一步验证了胶原VI（COL6A1、COL6A2）在SAN区域与相邻RA心肌相比的富集，如通过免疫组织化学和依赖的、公开可用的人类窦结节空间转录组数据集验证。

鉴于GPCR信号网络和 distinct ion channel expression profiles are central to the molecular identity of the SAN,研究人员试图通过使用相同的SAN组织样本增加测量深度来扩展我们先前的空间蛋白质组分析。为此，从图4中分析的四个SAN样本的肽段材料被汇集以启用离线高pH反相分级，随后跨16个肽段级分进行DDA-PASEF采集。这种方法 substantially expanded the detectable SAN proteome, yielding over 6,600 uniquely identified proteins-1.6-fold more than identified in the single-shot DIA measurements of the individual SAN samples。值得注意的是，与DIA数据集有98%重叠，显示方法之间强一致性。增加的深度改善了低丰度和膜相关蛋白质的覆盖，包括具有挑战性的靶点如β₁-和α_2A-adrenergic receptors。这些结果突出了在空间分辨组织中深度蛋白质组分析的价值，并进一步以高分辨率表征了人类SAN蛋白质组。

Proof-of-principle proteomic profiling of human myocardial biopsies from a retrospective patient cohort outlines the distinct signature of patients with ACM

研究人员接下来调查了使用我们 established workflow 分析来自回顾性临床队列档案FFPE组织收集的心脏疾病状态的可行性。我们的回顾性概念验证研究包括来自诊断为致心律失常性心肌病（ACM）的十名患者的心内膜心肌活检，以及来自十名用于移植的供体心脏的可比活检作为对照。遵循我们的样本处理工作流程和通过单次DIA分析的数据采集，研究人员在所有样本中识别了总共4,484种独特蛋白质。其中，4,055种基于跨ACM和供体队列的数据完整性标准保留用于定量分析。测量的蛋白质的PCA揭示了ACM和供体组之间的明显分离 along the first two principal components, effectively classifying samples based on disease state。

PCA负载的检查，代表了主成分的主要蛋白质贡献者，突出了与ACM组织学标志相关的蛋白质，如COL3A1、COL5A1和PRELP用于纤维化，FASN用于脂肪浸润。研究人员将我们的蛋白质组数据与已发布的人类心脏单核转录组学数据整合以识别细胞类型特异性标记。这些标记的分析显示ACM活检中成纤维细胞标记显著富集， alongside a notable trend for adipocyte markers。相比之下，心室心肌细胞标记在供体心脏中比ACM患者显著更丰富。

ACM和供体心脏之间差异表达蛋白质的进一步分析识别了167种丰度显著改变的蛋白质（Benjamini-Hochberg调整P<0.05，|logFC|>0.5）。其中，72种蛋白质更丰富，95种在ACM心脏中与供体心脏相比丰度较低。ACM心脏显示细胞骨架蛋白质ANKRD2和XIRP1水平降低，以及多种纤维化相关胶原水平增加，包括I型和II型胶原，以及TGF-β调节剂DPT和OGN。此外，研究人员观察到 catalase（对于防止氧化损伤重要）和激素敏感脂肪酶（指示增加甘油三酯代谢）的丰度升高。

为了确保人口统计学差异，特别是年龄和性别，不会混淆观察到的ACM和供体心脏之间的蛋白质组差异，研究人员通过拟合有和没有这些协变量的模型评估了它们的影响。跨所有蛋白质 resulting t-statistics 的比较揭示了强一致性（Pearson R>0.94），表明对整体差异丰度模式的影响最小。为了进一步证实区分ACM与供体心脏的蛋白质谱不受这些因素混淆，研究人员获取了38个额外供体心脏活检的蛋白质组谱。使用我们扩展的、更好匹配的对照的 combined analysis 产生了与原始分析强烈相关的效应大小， reinforcing that the observed proteomic signature likely reflects disease-specific alterations。研究人员还评估了FFPE块存储时间对扩展队列中蛋白质组质量的影响，发现与识别蛋白质数量无显著关联（R=0.093）。

为了阐明ACM和供体心脏之间蛋白质差异的细胞起源，研究人员使用人类心脏单核转录组学数据。对于所有在ACM和供体心脏之间具有显著差异的蛋白质，研究人员识别了表达每种蛋白质的主要心脏细胞类型。这种细胞类型-蛋白质关联的系统重建有效恢复了在 bulk 蛋白质组分析中丢失的信息，并提供了细胞类型富集与显著调节蛋白质之间的联系。分析显示显著调节的心肌细胞蛋白质在ACM心脏中与供体心脏相比主要下调，而显著调节的脂肪细胞和成纤维细胞蛋白质在ACM心脏中主要上调。图6g突出了 within cardiomyocytes, fibroblasts and adipocytes 的关键调节变化，这些变化区分了ACM心脏与供体心脏的蛋白质组谱。

为了验证观察到的ACM心脏中脂肪细胞和纤维化相对于供体心脏的增加，研究人员对来自10名ACM患者和10名供体对照的H&E染色心内膜心肌活检切片进行了定量组织学评估。使用立体学点计数方法，每个组织切片被系统评分心肌、纤维化和脂肪组织。该分析证实了ACM心脏中脂肪和纤维化组织比例高于对照。

这些结果展示了我们方法 uncovering molecular hallmarks of disease and identify specific protein remodeling characteristic of cardiac disease states by using retrospectively collected clinical biopsies 的能力。

讨论

FFPE组织在组学研究中的应用已变得越来越广泛，特别是在肿瘤学中；然而，其在心脏组织蛋白质组分析中的潜力仍未得到充分探索。先前研究FFPE人类心脏组织的研究证明了可行性，但面临显著限制。这些限制包括仅识别几百到低千种蛋白质，依赖二甲苯基脱石蜡步骤，非并行化组织样本处理工作流程以及需要长色谱梯度，所有这些都限制了可扩展性和通量。同时，揭示心血管疾病多因素性质的有意义见解——这些疾病由遗传变异、环境因素和生活方式风险之间复杂的相互作用引起——需要能够克服组织获取障碍的方法，通过从依赖FF组织过渡到利用FFPE组织，同时实现可比的蛋白质组覆盖。这一基准，特别是对于人类心脏组织，直到现在才达到。

同时，增加心脏FFPE组织的广泛使用有助于研究在临床诊断期间从活体患者收集的活检，提供了相对于通常在死后或移植时获得的FF样本的独特生物学优势。获取早期或中期疾病阶段对于研究动态病理过程至关重要，其中分子变化通常在广泛重塑之前是微妙和空间局部的。

在本文中，研究人员展示了如何利用FFPE心脏样本来揭示心脏病中的关键分子途径和解析空间亚结构， bridging histopathology with proteomics。研究人员显示这种方法适用于广泛的临床和研究设置，其中FFPE组织比其FF对应物更容易获得，并且可以长期存档。

研究人员强调了最近的技术改进，包括高效去除去污剂和疏水性污染物、板式样本处理、下一代质谱技术和先进计算工具，使我们能够现在追求基于FFPE的蛋白质组学作为当前FF组织研究金标准的可行替代方案。我们可扩展的96孔工作流程从最小存档材料中以无靶方式量化 expressed proteins，适应来自穿刺活检甚至宏观解剖组织的有限组织可用性。这些见解为识别 novel therapeutic targets, diagnostic markers and patient stratification strategies 提供了稳健基础。

解决关于福尔马林诱导交联的担忧，我们的实验设计有效解释了这些效应，在蛋白质水平留下最小可归因变异——这一发现与其他领域的观察一致。研究人员进一步证明来自匹配FFPE和FF组织的蛋白质组特征高度可重现，支持这些组织类型的可比性。然而，由于在获取此类独特匹配的人类心脏组织样本方面的技术挑战，这些比较仅限于我们的基准集，并且不能扩展到呈现的生物学案例研究。FF与FFPE蛋白质组的有效性和生物学相关性已在鼠模型和肿瘤学样本中得到解决，为未来研究在良好匹配的人类心脏病队列中验证FFPE蛋白质组提供了基础。

我们的FFPE工作流程支持与 isobaric labeling 的广泛分级以进行深度蛋白质组覆盖。虽然小规模TMT设置，如这里使用的单批设计，能够实现高度完整的数据集和精确比较，扩展到多批实验引入了挑战，包括缺失值膨胀和批效应，这需要仔细归一化和整合。这些问题影响可扩展性和数据一致性，突出了对专门解决由样本嵌套在TMTplexes中产生的独特缺失值模式和层次数据结构的需求。最终，这些限制 motivated 我们并行评估无标记DIA，其受益于确定性采样，导致高重现性和减少跨大型队列的缺失。特别是，单次 dia-PASEF 测量提供了深度和可扩展性之间的高效平衡，实现了稳健定量。研究人员证明传统先决条件，如样本汇集和离线分级用于DDA采集和库生成，不再必需，无库方法现在提供可比的深度和精度。

我们的案例研究突出了这种方法在揭示解剖区域（如人类窦结节）和疾病状态（如ACM）中的关键蛋白质组标志物的实用性。SAN intricate, crescent-like structure beneath the epicardial surface poses significant challenges for study。使用组织学引导解剖，研究人员获得了SAN的详细蛋白质组谱，提供了反映其独特组成的分子表征。这些谱揭示了SAN广泛的结缔组织（胶原和成纤维细胞）和独特的起搏细胞谱，与心房心肌细胞相比，具有更少的线粒体和减少的肌浆网/肌丝。此外， heart rate 的神经激素调节在富集的GPCR信号蛋白质中 evident，包括 established SAN markers such as PDE1A, GNAI1/2/3, CAMK2G and PRKACB, along with recently suggested markers like GNAO1, underscoring the power of spatial proteomics in resolving subregional cardiac biology。由于SAN组织通常仅在死后可用，研究人员注意到死后间隔（PMI）作为潜在混杂因素。我们研究的一个关键优势是配对设计，其中来自同一心脏的SAN和RA组织被比较， effectively controls for inter-individual sources of variation, including PMI。对于缺乏此类内部对照的研究，这一因素应在实验设计和下游解释期间仔细考虑，如最近证明。

在第二个案例研究中，研究人员通过分析来自ACM患者的存档心肌活检以及匹配的来自心脏移植的对照样本来评估工作流程在疾病分析中的效用。ACM，以纤维脂肪心肌浸润为组织学特征，提供了一个独特模型来评估蛋白质组谱是否 recapitulate pathological features。低输入活检的深度蛋白质组分析 routinely achieves a depth of 4,000 proteins，揭示了与纤维化和代谢失调相关的蛋白质，验证了工作流程对疾病背景的适用性。与其他回顾性FFPE研究一样，研究人员承认存档时间可能由于潜在蛋白质降解或长期存储的化学修饰而引入混杂效应。然而，先前调查显示存储10-15年的FFPE组织块保留了足够的完整性用于深度和可重现的蛋白质定量。与这些发现一致，研究人员在我们的数据集中未观察到可归因于块年龄的数据质量问题。尽管如此，研究人员强调存档时间作为回顾性蛋白质组研究中的一个相关因素，特别是在比较存储在不同时间框架的组织时。

随着蛋白质组技术的进一步进步和与激光捕获显微解剖等方法的潜在整合，研究人员预期以前所未有的深度和空间分辨率研究心脏组织，最终揭示以前无法访问的分子标志。这一进展为更全面和稳健的心脏研究打开了大门， enabling the discovery of novel biomarkers and therapeutic targets。