水溶液中Spinorphin及其丁酸衍生物的质子解离特性与体外抗炎活性研究

为解决内源性疼痛调节肽Spinorphin的生物活性机制不明及衍生物开发不足的问题，研究人员通过电位滴定法系统分析了Spinorphin及其三种丁酸衍生物（P1-P3）的质子解离常数和物种分布，并结合中性红摄取试验和Griess法评估其体外抗炎活性。研究发现丁酸修饰的特定衍生物（P2/P3）表现出潜在抗炎特性，为开发pH敏感型肽类药物载体提供了新思路。

　　

慢性疼痛的发生与中枢神经系统内源性疼痛调节机制密切相关，其中内源性阿片样物质（如脑啡肽、强啡肽和β-内啡肽）通过抑制疼痛信号传递发挥关键作用。Spinorphin（Leu-Val-Val-Tyr-Pro-Trp-Thr）作为一种从牛脊髓中分离的内源性脑啡肽降解酶抑制剂，已被证实具有镇痛和抗炎活性，但其作用机制和结构优化研究仍不充分。同时，短链脂肪酸丁酸（Butyric acid）作为结肠细胞重要能量源，近年被发现具有免疫调节潜力。然而，将丁酸与Spinorphin结合以增强其生物活性的研究尚未深入展开。

为阐明Spinorphin及其丁酸衍生物的理化特性与生物功能，波兰罗兹医科大学、格但斯克大学和克拉科夫理工大学的联合团队在《Amino Acids》发表了题为"Protolytic properties and biological activity of spinorphin and its butyric acid derivatives in aqueous solution"的研究。该工作通过固相合成法制备了三种新型Spinorphin丁酸衍生物：（P1）丁酰基-Lys-Lys-Leu-Leu-Val-Tyr-Pro-Trp-Thr、（P2）丁酰基-Lys-Lys-Leu-Val-Val-Tyr-Pro-Trp-Thr（丁酸连接于赖氨酸α-氨基）和（P3）Lys(丁酰基)-Lys-Leu-Val-Val-Tyr-Pro-Trp-Thr（丁酸连接于赖氨酸ε-氨基），并以电位滴定法系统分析了其质子解离常数、物种分布曲线及金属离子结合潜力，同时通过中性红摄取试验（NRU）和Griess法评估了它们在RAW264.7巨噬细胞系中的细胞毒性与抗炎活性。

关键技术方法包括：①固相合成与反相高效液相色谱（RP-HPLC）纯化（纯度>95%）；②电位滴定法（0.1 M NaClO₄，pH 2.00-12.00）计算质子解离常数；③物种分布模拟（HySS软件）；④体外细胞实验（RAW264.7细胞系，来源：ATCC TIB-71）；⑤中性红摄取试验评估细胞毒性；⑥Griess法检测LPS诱导的NO₂^-生成。

肽合成与纯化

通过MALDI-TOF质谱和RP-HPLC验证了所有肽的分子量与纯度（>95%），其中（P1）-（P3）的保留时间分别为17.91 min、17.32 min和17.84 min，而天然Spinorphin（P4）为15.21 min（表1）。

pH电位滴定

研究测得Spinorphin（P4）存在三个质子解离常数（pK_a1=2.21, pK_a2=9.97, pK_a3=10.18），分别对应苏氨酸羧基、亮氨酸氨基和酪氨酸酚羟基的解离（表2）。衍生物（P1）-（P3）均显示四个质子解离常数，其中（P1）的pK_a1=2.43（苏氨酸羧基）、pK_a2=9.75（酪氨酸羟基）、pK_a3=10.00与pK_a4=10.37（两个赖氨酸ε-氨基）；（P2）的pK_a值分别为2.65、9.60、10.34和10.42；（P3）则因丁酸修饰位点差异呈现独特解离顺序（pK_a1=2.26, pK_a2=9.50, pK_a3=9.89, pK_a4=10.26）。物种分布曲线（图4）表明，所有肽在生理pH（7.4）下主要以中性或单负电荷形式存在，且多个可解离基团提示其具备与金属离子（如Cu²⁺、Ni²⁺）形成配合物的潜力。

NRU试验

中性红摄取试验显示（图5），所有肽在10^-6–10^-9 g/mL浓度下均未表现显著细胞毒性，仅（P4）在10^-9 g/mL时引起5.55%的 viability下降（p<0.002），证实其生物相容性良好。

Griess试验

在LPS刺激的RAW264.7细胞中，（P2）和（P3）表现出浓度依赖性（（P3））或反浓度依赖性（（P2））的NO₂^-生成抑制趋势，提示潜在抗炎活性，但未达统计显著性（图6）。而（P1）因N端丁酸连接及缬氨酸→亮氨酸替换完全丧失该活性，表明丁酸修饰位点与肽序列对抗炎功能具有关键影响。

本研究通过理化与生物学分析证实，Spinorphin衍生物（P2）和（P3）因其可调节的质子解离特性与金属离子配位能力，有望作为pH响应型药物载体，且其抗炎潜力为开发新型镇痛抗炎肽提供了实验依据。后续研究需深入探索这些肽与金属离子的配合物结构及其在体内模型中的药理活性。