HIV感染通过KLF2和p53通路重编程CD4+ T细胞进入静息状态并建立病毒潜伏库

本研究发现HIV感染通过激活KLF2和p53信号通路，下调MYC表达，诱导CD4+ T细胞转录组重塑和静息程序（quiescence programme），导致原病毒转录沉默（proviral silencing）和潜伏库形成。这一机制揭示了病毒持久存在的新途径，为靶向HIV潜伏库的治疗策略提供了关键理论基础。

　　

HIV感染重编程CD4⁺ T细胞进入静息状态和原病毒潜伏的机制

研究背景

人类免疫缺陷病毒（HIV）在感染个体中持续存在，尽管抗逆转录病毒治疗（ART）有效，但由于潜伏库的快速建立，主要存在于静息记忆CD4⁺ T细胞中。潜伏库形成的机制仍知之甚少。本研究通过单细胞RNA测序（scRNA-seq）和功能研究，在人类原代CD4⁺ T细胞模型中揭示，HIV感染触发转录组重塑，激活p53通路和Krüppel样因子2（KLF2）介导的静息程序。

主要发现

HIV感染诱导转录组关闭

研究使用原代人类CD4⁺ T细胞模型（QUECEL），该模型提供高度纯化、同质化的Th1、Th2、Treg和Th17极化HIV感染细胞。通过假型单轮HIV病毒（基于NL4-3株，含有CD8-EGFP融合蛋白）感染极化细胞，可温和高效纯化感染细胞。QUECEL模型已通过从感染到静息的原病毒成像、关键转录因子隔离和静息期间异染色质测量进行广泛表征。

RNA-seq分析显示，在未感染、载体感染和纯化HIV感染细胞中，静息和αTCR 24小时组内聚类在一起，具有非常相似的全局基因表达模式。相比之下，+HIV 72 hpi形成一个 distinct 簇，表明病毒诱导的转录组变化。Th1、Th2、Th17和Treg极化细胞在基因表达变化上几乎相同。

静息状态转录组特征包括已知的静息调节因子KLF2、TOB1和CDKN2B的上调。相反，多个通路包括MYC信号和MTORC通路（T细胞增殖期关键驱动因子）下调，与细胞周期、转录和翻译调节以及细胞代谢相关的通路也下调。这些基因表达变化在TCR刺激后 largely 逆转。上调的基因和通路包括几个细胞生长和增殖标志物和通路，包括MYC和E2F信号，而静息标志物下调。

HIV感染导致与静息细胞相同的转录组变化

维度降低研究和Jensen-Shannon divergence计算显示，+HIV 72 hpi细胞与静息细胞聚类接近。与在相同增殖支持培养基中维持的未感染和+vector 72 hpi细胞相比，+HIV 72 hpi细胞显示主要的转录下调模式，超过1,150和2,400个蛋白质编码基因分别上调和下调。HIV感染后改变的细胞通路 closely 类似于未感染和+vector细胞进入静息后下调的通路。

HIV下调的通路对应于关键增殖通路，包括MYC和mTORC1信号，与 reduced 转录和翻译活性一致。代谢通路如糖酵解、脂肪生成和氧化磷酸化同样显示活性降低。这些变化并非由于无法响应IL-2，因为尽管这些细胞中IL-2受体IL-2RA/CD25在RNA水平下调，但CD25蛋白水平在HIV感染细胞48 hpi时未显示下降，而静息程序的激活在此时间点 clearly 可检测。此外，显示静息转录程序的细胞可以高效响应IL-2添加。

相比之下，向+HIV细胞添加静息诱导细胞因子后，进入完全静息状态伴随关键细胞增殖和代谢通路的相对温和变化。由于完全静息的+HIV和+vector细胞在基因表达模式上 largely 相同，这些结果表明HIV感染72小时后，细胞已经经历了实现完全静息状态所需的大部分转录组变化。

总之，转录组结果以及验证性 western blots 表明，HIV感染导致关键静息标志物KLF2、TOB1和CDKN2B的表达增加，以及增殖标志物如CD25/IL-2RA、CD71/TFRC和MYC的下调。流式细胞术研究增殖标志物细胞周期蛋白D3和Ki67显示，在未纯化、 minimally 干扰的HIV感染细胞中，与未感染细胞相比，蛋白质水平 correlated 减少，最早在感染后48小时开始。类似地，通过生长曲线计算和CellTrace增殖 assay 分析+vector 72 hpi和+HIV 72 hpi细胞的生长速率显示，HIV感染后2天开始细胞生长 clear 减少，反映了群体中感染细胞的比例，而两组显示相似的 viability。

HIV感染诱导对MYC信号的阻断，CD4⁺ T细胞中的关键增殖因子

HIV感染后差异表达基因启动子附近转录因子结合位点的富集模式指出，CD4⁺ T细胞中两个主要增殖转录因子MYC和E2F结合位点的基因表达 strongly 显著减少。

HIV感染响应和进入完全静息期间基因表达变化的时间模式表明，几个关键增殖调节通路和基因，最显著的是MYC靶基因和MYC本身，在HIV感染后早期时间点（72小时内）显示强烈快速下调。第二组调节通路和基因，如细胞周期蛋白和E2F家族基因及通路，主要在后期时间点（HIV感染后4-14天）下调，包括添加静息诱导细胞因子后进入完全静息期间。在上调通路中，p53通路及其下游Wnt/β-catenin信号通路属于“早期”响应组。此外，几个静息基因，包括KLF2、CDKN2B、CDKN1A、SMPD3和SMAD3，也主要在HIV感染后早期时间点诱导。

尽管HIV感染对静息程序转录程序诱导的影响先前被忽视，但此表型的个别方面已在文献中被 noted，包括CD4⁺ T细胞中激活状态相关基因表达减少，转录、RNA加工、翻译、代谢、增殖相关通路和细胞生长速率抑制。为确定研究结果的再现性和普遍性，使用了多个独立进行的RNA-seq研究，涉及早期HIV感染时间点，来自公共数据库，其中使用不同复制能力HIV株（来自LAI和NL4-3克隆）和原代HIV分离株实现高感染水平，用于感染 diverse CD4⁺ T细胞系和原代CD4细胞。对这些额外RNA-seq研究的重新分析显示，关键细胞通路变化与本研究几乎相同。这些包括p53通路上调和关键增殖通路下调，最显著的是MYC和E2F信号及细胞周期相关通路。还分析了用六种不同HIV株感染纯化原代CD4⁺记忆细胞，所有都显示HIV诱导静息表型的诱导。

最后，询问不同极化CD4⁺ T细胞在HIV感染后是否显示差异转录组模式。虽然所有测试极化细胞显示MYC信号强烈下调，但E2F信号在Th17极化细胞中不是强参与者。有趣的是，MYC已被证明是E2F信号的强调节因子。HIV感染后E2F家族成员（正向调节T细胞增殖的E2F1、2和3）表达水平变化幅度远小于MYC下调水平，表明E2F信号变化可能是MYC转录活性 reduced 的次要反应。

为确定MYC下调 alone 是否可重现观察到的HIV诱导基因表达变化，将MYC靶向和非靶向控制短干扰（si）RNA电穿孔到增殖、未感染原代CD4⁺ T细胞中以敲低MYC。MYC水平减少导致多个增殖通路下调和基因表达模式，非常 closely 模拟HIV感染后观察到的。流式细胞术研究确认增殖标志物丢失， viability 水平无变化，类似于HIV感染后观察到的。

KLF2和p53信号通路早期激活下调MYC并启动静息程序

为定义HIV感染后MYC下调的机制，接下来研究p53通路早期激活的潜在贡献，p53是已知的MYC负调节因子。用两种已知p53激动剂RITA和nutlin处理增殖原代人类CD4⁺ T细胞导致p53诱导，伴随细胞增殖 slowdown 和24小时内增殖标志物 pronounced 下调， viability 无或微小变化。相反，HIV感染前用pifithrin（已知p53拮抗剂）预处理细胞导致显示静息表型（细胞周期蛋白D3?, Ki67?）细胞 fraction 显著减少 compared to vehicle-treated 细胞。RITA处理细胞的RNA-seq研究指出MYC和几个MYC靶基因下调，尽管幅度低于HIV感染后观察到的，指向静息转录组签名诱导中额外因素的参与。

为找到可能扮演此角色的潜在候选基因，识别了与MYC水平负相关的HIV诱导基因。有趣的是，KLF2，一个已知的MYC强负调节因子和CD4⁺ T细胞静息关键诱导因子，是在多个研究中与MYC负相关性最强的基因之一，无论是否存在HIV。在~100个HIV感染后一致上或下调的蛋白质编码基因中，最上调的基因是KLF2。相比之下，MYC是在HIV感染后一致显示强烈下调的基因之一。

原代人类CD4⁺ T细胞中用HIV报告病毒感染后的时间过程研究表明，KLF2水平在24 hpi显著上调，并在48 hpi显示进一步增加，达到与静息记忆细胞相当的水平。重要的是，这种增加不是细胞应激的被动副作用，而是取决于HIV原病毒整合到基因组中，因为raltegravir添加阻止了KLF2水平上升。KLF2敲低阻止进入静息，即使敲低细胞在静息诱导培养基中培养，不影响 viability。通路分析指向进入静息期间下调通路的诱导，包括糖酵解、MTORC信号和HIF1a下游基因（缺氧通路）。另一方面，用simvastatin（已知KLF2诱导剂）处理增殖原代人类CD4⁺ T细胞强烈减少增殖标志物表达，不影响细胞 viability，与退出增殖状态一致。

为补充上述研究，还进行了针对15,000个细胞蛋白质编码基因的无偏短 hairpin RNA（shRNA）筛选，以识别那些涉及HIV转录活性正或负调节的基因。由于原病毒激活与T细胞激活状态 strongly 相关，参与抑制T细胞激活的因子功能丧失将在筛选中产生阳性命中。有趣的是，~40个在HIV感染后一致上或下调的基因在shRNA筛选中富集，KLF2和MYC分别在此列表中 most 正和负富集基因。CDKN1A/p21，一个已知p53效应基因和细胞周期阻滞强诱导因子，也是正富集基因之一。有趣的是，一个独立进行的shRNA筛选研究识别KLF2为维持HIV潜伏的关键因子。这些数据不仅表明KLF2和MYC是HIV感染后最差异调节的基因和通路之一，而且它们的功能丧失足以分别诱导和阻止HIV潜伏逆转，可能通过调节CD4⁺ T细胞中激活和静息状态之间的平衡。

单细胞（sc）RNA-seq证明KLF2和p53通路激活与原病毒转录关闭相关

还对来自健康供体的原代CD4⁺ T细胞进行了scRNA-seq分析，包括两个生物重复外加技术重复。包括感染前样本、用HIV报告病毒96 hpi后样本、感染细胞在静息诱导培养基中孵育14天后样本和静息细胞通过TCR刺激 reactivation 后24小时样本。与 bulk RNA-seq结果一致，维度降低研究表明，在增殖培养基中维持的+HIV 96 hpi细胞与相同维持的未感染细胞 distinct，占据未感染和静息细胞之间的位置。多个增殖和代谢激活标志物在+HIV静息和96 hpi细胞中与增殖未感染和+HIV αTCR 24小时细胞相比负富集。

+HIV 96 hpi细胞中HIV表达水平分析表明，那些具有MYC表达签名的细胞具有最高HIV表达水平（MYC+细胞）。这些细胞 also 具有最高的 unique molecular identifier（UMI）计数 per cell，与更激活表型一致。表达p53激活标志物但无KLF2表达的细胞具有较少的细胞RNAs，与更静息表型一致，但仅 modestly reduced HIV表达水平，表明p53信号诱导 per se 不足以转录沉默原病毒（KLF2?p53+细胞）。相比之下，KLF2表达细胞，即使无p53信号，具有 much 更少的RNAs per cell 并将原病毒转录限制在基础水平（KLF2+p53?细胞）。重要的是，KLF2和p53信号均激活的细胞显示HIV原病毒转录活性强烈减少，与原病毒转录相比平均减少>75% compared to MYC+细胞（KLF2+p53+细胞）。这种强烈减少的原病毒转录水平在KLF2+p53+细胞中在标准化原病毒表达水平到总细胞计数前后均观察到。因此，感染后KLF2和p53通路并发激活，除了重编程细胞进入静息，还 sharply 减少原病毒基因表达，为原病毒潜伏和潜伏库形成设置阶段。

最后，使用来自Sabes项目的原代CD4⁺ T细胞，该项目包括6名HIV阳性供体在病毒血症状态和一年cART介导抑制后的细胞。分析了在基础状态和体外抗原介导 reactivation 后获得的scRNA-seq数据，在存在10 μM enfuvirtide下9小时，导致HIV转录诱导。在基础状态，细胞显示高KLF2水平和与静息状态一致的基因表达模式，包括低MYC水平。MYC和其他T细胞激活标志物水平，包括IL-2和CD40LG，在 reactivation 后显示 dramatic 增加，伴随KLF2水平强烈减少。轨迹分析表明存在多个静息群体，对应于静息 naive 和记忆细胞，代表 pseudotime 起点。 reactivation 后，检测到三个不同激活状态细胞群体，代表 pseudotime 下游阶段，MYC^high CD40LG^high KLF2^low细胞构成 reactivated 细胞主要群体。

为确定KLF2表达与CD4⁺ T细胞静息/休息状态关联程度，使用Sabes RNA-seq数据集训练逻辑回归模型，CD40LG（CD4⁺细胞中激活状态强标志物）用作控制。如预期，逻辑回归模型证明CD40LG是激活状态强预测因子。KLF2类似地作为静息/休息状态强预测因子执行，系数+3.3（置信区间：3.24–3.42）。准确度、精确度和召回值分别为0.83、0.89和0.74，证明KLF2是静息/休息细胞的准确敏感标志物。一致地，接收者操作特征（ROC）曲线显示KLF2和CD40LG的曲线下面积（AUC）分别为0.84和0.88，证明两者分别是静息和激活状态的优秀预测因子。

尚未定义哪些HIV基因参与HIV介导静息程序诱导。然而，Tat似乎贡献表型。使用由于启动子甲硫氨酸突变为苏氨酸而无法表达Rev基因的病毒 HIV构建体。此突变有效阻止HIV蛋白质表达 except for Tat和Nef。用此突变构建体和含有野生型Rev基因的构建体感染人类原代CD4⁺细胞导致 comparable 静息程序诱导，表明Tat可能贡献HIV诱导静息程序诱导。这与可溶性Tat由于IL-10诱导具有抗增殖效应的报告一致。然而，Tat由于诱导凋亡通路的间接效应也可能贡献这些表型。

讨论

数据揭示潜伏库形成的一个先前未知方面，其中原病毒蛋白质表达，可能Tat，在HIV感染和原病毒整合后 shortly 导致多管齐下静息机制激活。此过程通过静息p53信号级联和KLF2等因子激活介导，导致MYC表达抑制，已知在维持T细胞激活状态中起 pivotal 作用。 resulting 关键增殖和代谢通路下调，进而导致细胞静息和原病毒转录关闭，至少在感染细胞子集中。

已显示HIV感染后 shortly，IFN响应和细胞应激诱导导致p53激活。除了静息功能，p53可通过多种机制直接限制HIV复制和原病毒基因表达。虽然p53诱导导致部分HIV感染细胞凋亡，但HIV感染后 pro-静息、 pro-生存因子KLF2表达 steep 上升导致CD4⁺ T细胞生存和静息诱导。与p53对比，HIV感染后KLF2诱导机制未知，且原代CD4⁺ T细胞用IFNα处理后无KLF2上调不支持可能性，即类似p53，KLF2上调由先天免疫响应诱导。FOXO1，CD4⁺ T细胞稳态关键因子，已显示在KLF2诱导中起作用。可能病毒整合后细胞应激和/或DNA损伤响应导致FOXO1激活，进而诱导KLF2表达。HIV感染后原病毒整合对KLF2诱导必要的观察与此可能性一致。然而，来自表达原病毒基因的可能Tat的额外信号需要用于KLF2诱导和静息表型，因为用空 lentiviral 载体转染细胞与对照相比未显示KLF2水平上升。

来自工作和他人积累证据记录进入静息与原病毒潜伏密切关联。虽然此HIV诱导静息程序启动和进展的许多方面仍有待研究，但HIV感染后 shortly CD4⁺ T细胞静息重编程观察表明，潜伏感染细胞群体形成是HIV感染固有结果，指向潜伏库形成不可避免性。