PacBio三代测序与ddPCR技术在HIV/AIDS患者肺部感染微生物组诊断中的比较研究

《BMC Infectious Diseases》：Comparison of the microbiome of sputum from HIV/AIDS patients using PacBio 16S rRNA sequencing and ddPCR

本研究针对HIV/AIDS患者肺部感染病原体诊断难题，比较了传统培养法、PacBio全长16S rRNA测序和微滴式数字PCR(ddPCR)的诊断效能。结果显示，PacBio测序阳性检出率达100%，可识别51个物种77个菌株，ddPCR检测15个物种64个菌株，远优于传统培养法（仅3个物种6个菌株）。两种新技术能有效揭示混合感染和耐药基因（如mecA、blaNDM/blaIMP），为免疫缺陷患者肺部感染的精准诊疗提供新方案。

　　

在免疫缺陷患者的临床诊疗中，肺部感染始终是导致高死亡率的核心挑战。特别是HIV/AIDS患者，由于其CD4⁺T淋巴细胞数量显著下降，免疫系统功能严重受损，使得普通微生物也可能成为致命威胁。传统微生物培养方法虽被视为金标准，却存在检测周期长、阳性率低、无法覆盖难培养微生物等固有局限。在这一背景下，福建医科大学孟超肝胆医院的研究团队在《BMC Infectious Diseases》发表论文，系统比较了第三代PacBio单分子实时测序技术（SMRT）与微滴式数字PCR（ddPCR）在HIV/AIDS合并肺部感染患者痰液微生物检测中的诊断价值。

为全面评估不同技术的诊断性能，研究团队收集了37名艾滋病合并肺部感染患者的45份痰液样本，并采用传统培养、PacBio全长16S rRNA基因测序和ddPCR三种方法进行平行检测。PacBio测序基于其超长读长（约1.5 kb）和高精度环形共识序列（CCS）技术，可实现物种级别微生物鉴定；ddPCR则通过微滴分割和荧光信号数字化，实现病原体和耐药基因的绝对定量。

研究结果显示，传统培养法仅检出5例阳性样本，涵盖3种细菌（6株），全部为革兰氏阴性菌。而PacBio测序在所有45例样本中均检测到微生物信号，共识别出51个物种（77株），其中优势菌群包括Rothia mucilaginosa（24株）、Granulicatella adiacens（21株）和Streptococcus infantis（18株）。值得注意的是，在传统培养阴性的样本中，PacBio仍能检测到丰富的微生物群落，提示其在高灵敏度微生物筛查中的突出价值。

进一步通过ddPCR对7例代表性样本（含5例培养阳性和2例培养阴性）进行验证，结果显示其可检测到15个物种（64株），并成功识别mecA和bla_NDM/bla_IMP等耐药基因。值得注意的是，在传统培养阴性样本中，ddPCR与PacBio测序均检出包括肺炎克雷伯菌、大肠埃希菌在内的多种病原体，证实两种技术对隐性感染的检测能力。

在诊断性能方面，PacBio测序与ddPCR均表现出100%的灵敏度与阴性预测值，但特异性为0%，这反映出分子检测技术对微生物存在的高度敏感性，也提示在临床解读中需结合患者临床症状进行综合判断。

研究结论表明，PacBio全长16S测序能全面绘制HIV/AIDS患者肺部微生物群落图谱，而ddPCR在常见病原体快速鉴定、耐药基因检测方面具有定量优势。两种技术形成互补，为传统培养方法提供了有效的替代方案。该研究为免疫缺陷患者肺部感染的精准诊疗提供了新思路，尤其对混合感染和耐药性监测具有重要临床意义。未来通过优化检测流程与成本控制，这类技术有望成为危重感染患者诊断的重要工具。

方法学概要

研究纳入福建医科大学孟超肝胆医院37例艾滋病合并肺部感染患者的45份痰样本，采用氢氧化钠液化处理后进行DNA提取。通过PacBio Sequel II平台进行全长16S rRNA基因测序（引物27F/1492R），使用DADA2流程生成ASVs（扩增子序列变体），基于SILVA数据库（v138.1）进行物种注释。ddPCR采用五通道微滴数字PCR系统，使用Pilot Gene Technology公司的多重检测试剂盒（CE-IVD认证）对25种病原体和5种耐药基因进行绝对定量。

研究结果

传统痰培养病原菌检测

传统培养法仅检出6株革兰氏阴性菌（大肠埃希菌3株、铜绿假单胞菌2株、肺炎克雷伯菌1株），阳性率8.89%，凸显传统方法在检测范围和灵敏度方面的局限。

PacBio测序病原菌检测

测序共获得1,426,463条高质量CCS序列，平均读长1,462 bp，鉴定出13,168个OTUs（操作分类单元）。物种组成分析显示，Rothia mucilaginosa（5.06%）、Prevotella melaninogenica（4.40%）和Granulicatella adiacens（3.38%）为优势菌群。从各样本前10位高丰度菌株汇总出的329株细菌中，革兰氏阳性菌占60.49%，显著高于传统培养结果。

7例样本的ddPCR验证

ddPCR检出64株微生物（13个物种），其中革兰氏阴性菌占53.13%（鲍曼不动杆菌7株、大肠埃希菌6株），同时检测到9株念珠菌和9个耐药基因（mecA、bla_NDM/bla_IMP），展现其在混合感染和耐药性监测方面的优势。

三种方法比较

在培养阳性样本中，PacBio与ddPCR检测结果高度一致；在培养阴性样本中，两种技术均检出显著微生物信号。PacBio在物种覆盖广度上优势明显（51 vs 3种），而ddPCR在真菌检测和耐药基因定量方面具有独特价值。

讨论与结论

本研究通过多维技术对比，证实第三代测序与ddPCR在HIV/AIDS肺部感染诊断中具有显著优势。PacBio技术凭借全长16S rRNA测序能力，可精确解析呼吸道微生态结构；ddPCR则能实现病原体绝对定量和耐药基因快速检测。两种技术互补应用，可突破传统培养法的技术瓶颈，为临床提供更全面、精准的病原学诊断依据。值得注意的是，分子检测结果需结合患者免疫状态、临床表现进行综合解读，以区分定植菌与真实致病菌。该研究为免疫缺陷患者肺部感染的精准诊疗策略制定提供了重要技术支撑。