珊瑚内共生菌Endozoicomonas两大分支的基因组互作预测：营养循环与环境适应的新机制

本研究针对珊瑚-细菌共生机制尚不明确的问题，通过对Acropora loripes珊瑚中分离的11株Endozoicomonas菌株进行长读长和短读长全基因组测序，开展了比较基因组学分析。研究揭示了两个分支(Clade-A和Clade-B)在碳水化合物代谢、磷获取和免疫逃避机制方面的显著差异，首次发现Clade-A具有D-葡萄糖醛酸降解途径可能参与宿主激素代谢，并鉴定出分支特异的VI型分泌系统(T6SS)和效应分子。这些发现为理解珊瑚全共生体营养循环、生殖健康和环境适应提供了新的分子机制。

　　

在广阔的珊瑚礁生态系统中，石珊瑚作为关键的生态系统工程师，不仅与虫黄藻(Symbiodiniaceae)形成著名的光合共生关系，还容纳了包括细菌、古菌、病毒和真菌在内的多种微生物，共同构成了复杂的"全共生体"(holobiont)。虽然珊瑚-虫黄藻的互作已被广泛研究，但珊瑚与细菌之间的共生关系仍笼罩在神秘之中，这些关系可能从互利共生到拮抗作用不等。在众多珊瑚相关细菌中，Endozoicomonas属因其广泛存在性和在珊瑚组织中形成高密度聚集体（细胞相关微生物聚集体，CAMAs）的能力而备受关注。然而，尽管它们在珊瑚微生物组中相对丰度较高，但不同Endozoicomonas菌株或物种对珊瑚生化途径的具体功能贡献仍知之甚少。

近期研究发现，从常见造礁珊瑚Acropora loripes中分离的11株Endozoicomonas菌株根据16S rRNA基因序列可分为两个明显不同的分支（Clade-A和Clade-B）。有趣的是，这些分支在宿主内的空间分布显示出截然不同的聚集形态：Clade-A成员形成具有清晰边界的有结构聚集体，而Clade-B成员则呈现无限制生长、缺乏明确边界的簇状结构。这种形态差异引发了重要问题：不同的聚集模式是否对应于Clade-A和Clade-B菌株基因组特征的差异？它们与珊瑚宿主形成的共生类型有何不同？

为了解决这些问题，研究人员对11株Endozoicomonas菌株进行了全基因组测序和比较基因组分析，旨在阐明：（1）Endozoicomonas与其他全共生体成员（珊瑚或虫黄藻）之间获取和转移营养物质的潜在机制；（2）潜在调控聚集模式的分子机制；（3）Endozoicomonas应对营养缺乏和宿主免疫反应等环境挑战的机制。

研究发现这些Endozoicomonas菌株拥有相对较大的基因组（5.8-7.1 Mbp），具有较高的编码密度，这表明它们不是典型的专性共生菌，而是具有自由生活阶段的细菌。系统基因组学分析证实了先前基于16S rRNA基因的分类，11个分离株分为两个不同的系统群：Clade-A（4个分离株）和Clade-B（7个分离株）。值得注意的是，尽管来自同一珊瑚群落，两个分支之间的平均核苷酸一致性(ANI)仅为约70%，平均氨基酸一致性(AAI)约为23%，表明这些群落在进化历史上很早就发生了分化。

研究人员采用长读长(Nanopore)和短读长(Illumina)全基因组测序技术，结合Flye和SPAdes组装器进行基因组组装，使用Medaka和POLCA进行抛光。通过CheckM评估基因组完整性和污染度，利用GTDB-Tk进行系统基因组学分析，采用Prokka和RAST进行基因预测和注释，使用BlastKOALA和KEGG-mapper进行代谢通路重建，并通过InterProScan鉴定真核样蛋白结构域。信号肽预测使用SignalP和PSORTb，效应分子预测采用Bastion6工具。

基因组装特征

全基因组测序显示所有组装都具有高完整性(99.1±0.1%)和低污染水平(1.3±0.7%)。Clade-A的GC含量平均为49.3±0.1%，Clade-B为47.8±0.1%。Clade-A基因组较小(6.01±0.2 Mbp，编码密度84.95±0.9%)，而Clade-B基因组较大(7.01±0.1 Mbp，编码密度85.7±1.5%)。

碳水化合物的获取与转移

代谢重建揭示了两个分支在利用全共生体衍生碳源方面的不同策略。Clade-A具有通过Leloir途径摄取和同化半乳糖的完整遗传潜力，包括高亲和力半乳糖转运系统Mgl。这表明Clade-A能够有效利用虫黄藻光合产物中的半乳糖。相反，Clade-B缺乏Leloir途径中的三个关键基因，但具有完整的果糖利用途径，可能利用来自宿主摄食的葡聚糖和浮游植物分解产生的果糖。

特别值得注意的是，Clade-A编码多种预测的外切酶，包括水解淀粉所需的α-淀粉酶和其他降解复杂多糖的酶（如支链淀粉酶），这些在Clade-B中缺失。这表明Clade-A有潜力获取珊瑚组织内储存的能量储备，将淀粉等光合产物转化为简单的生物可利用糖类。

糖胺聚糖降解（D-葡萄糖醛酸降解）

Clade-A菌株具有完整的D-葡萄糖醛酸降解途径，这是此前在Endozoicomonas中未报道的。该途径的关键酶β-葡萄糖醛酸酶(GUS)能够从糖胺聚糖（也称粘多糖）末端切割GlcA，这些多糖常见于珊瑚粘液中。

更重要的是，这一发现暗示了Endozoicomonas可能参与宿主"性类固醇"激素代谢。在珊瑚中，主要"性型"类固醇激素通常与GlcA结合存在，如雌二醇葡萄糖醛酸和睾酮葡萄糖醛酸。这些结合激素在珊瑚组织和周围海水中都有检测到，浓度在大型产卵事件前达到峰值。微生物去除GlcA可能会通过将激素返还给更脂溶性的形式而延长它们在珊瑚组织内的保留时间。

从珊瑚宿主或虫黄藻降解和摄取脂质的潜在机制

当虫黄藻转移的固定碳过量时，会以脂质形式存储在宿主体内，如三酰甘油(TAGs)、蜡酯、磷脂和游离脂肪酸(FAs)，这些约占珊瑚总干生物量的10-40%。Clade-A成员具有使用细胞外TAG脂肪酶HlyC将TAG降解为游离脂肪酸的基因组潜力，并伴有必要的脂肪酶伴侣LifO，用于在通过胞外环境中的周质期间进行适当的蛋白质折叠。

两个分支都通过FadL蛋白具有从细胞外环境获取长链脂肪酸的代谢能力。三酰甘油的细胞外水解产生游离脂肪酸和甘油。Clade-A具有UgpBAEC(Ugp)转运系统，而两个分支都具有GlpF，促进甘油摄取。在Clade-B中，甘油-3-磷酸(G3P)也可以通过GlpT转运蛋白导入，与无机磷酸盐(Pi)的输出耦合。

Endozoicomonas在磷获取中的潜在作用

珊瑚相关微生物必须竞争有机磷(Po)和无机磷(Pi)形式的磷。研究人员发现两个分支都具有推定的碱性磷酸酶(APases)：两个分支都有phoX，只有Clade-B有phoD。这两个蛋白质都含有信号肽，因此预计是细胞外的。

细胞外DNA(exDNA)和核酸是另一个主要的有机磷来源。Clade-A基因组编码两个周质5'和3'核苷酸酶，与霍乱弧菌的UshA和CpdB核酸酶同源。Clade-B基因组编码一个细胞外脱氧核糖核酸酶dns，与霍乱弧菌的核酸酶(Dns)有60.8%的蛋白质同源性。

聚集模式的潜在机制

细菌最外层表面的分子在细菌-宿主互作中起着重要作用。Clade-B具有几个在Clade-A中缺失的完整荚膜多糖(CPS)合成途径，包括UDP-N-乙酰甘露糖胺(UDP-ManNAc)、GDP-L-岩藻糖(GDP-L-Fuc)和CMP-N-乙酰神经氨酸(Neu5Ac/唾液酸)的生物合成。由唾液酸组成的荚膜在临床微生物学中备受关注，因为它们可以通过模拟真核细胞表面糖缀合物来帮助细菌逃避宿主免疫系统。

相反，Clade-A含有一个与铜绿假单胞菌Wbp途径同源的LPS基因簇，编码所有五种酶，用于从头合成二-N-乙酰甘露糖胺糖酸，这种糖酸通常存在于革兰氏阴性细胞壁的最外层部分(O抗原层)。

促进逃避宿主免疫反应的因素

两个分支的基因组都编码大量真核样蛋白(ELPs)，如WD40、锚蛋白和Sel1样重复序列。Clade-B的WD40和锚蛋白重复序列数量明显高于Clade-A，而Sell样重复序列仅在Clade-A中富集。

特别令人感兴趣的是锚蛋白包含蛋白AnkX，它在一种Clade-B菌株(AL032)中发现了五个拷贝，该菌株在A. loripes的宿主内细菌群落中占主导地位。在人类细胞内病原体嗜肺军团菌中，AnkX用于修饰真核宿主膜运输蛋白，抑制吞噬作用并增加细菌在宿主细胞内的存活。

促进宿主定殖和竞争的分泌因子

Endozoicomonas基因组拥有与宿主定殖和粘附相关的遗传 repertoire，鉴定出多个近乎完整的分泌系统，包括I型、II型、III型和VI型。虽然几乎所有分泌系统都在两个分支中检测到，但编码T6SS装置的近乎完整的VI型分泌系统(T6SS)基因簇仅在Clade-A中鉴定到。

预测为T6SS效应分子的蛋白质包括A1/A2磷脂酶(PLA)和碱性磷酸酶PhoX。PLA是一种外膜脂肪酶，先前在假单胞菌和大肠杆菌中被描述为水解磷脂酰丝氨酸(PS)和磷脂酰胆碱(PC)的酯键。

研究结论显示，Endozoicomonas细菌的代谢适应性及其对珊瑚全共生体动态的潜在贡献得到了充分证明。代谢重建揭示了先前未描述的酶 repertoire，表明利用了复杂的宿主衍生化合物，包括淀粉、脂质化合物，以及有机磷和激素结合物的清除。此外，研究人员确定了每个分支内与多种宿主定殖策略相关的基因组特征，无论是通过外表面结构的修饰还是定向T6SS效应分子的分泌。

这些发现强调了不同Endozoicomonas物种在共享的全共生体资源（即来自虫黄藻和/或异养摄食的摄入物质的珊瑚组织中储存的碳水化合物）方面制定了不同的获取策略。它们利用各种全共生体衍生化合物作为碳源的能力强调了该属对宿主环境的代谢适应性。这种灵活性可能赋予Endozoicomonas种群在宿主环境内的竞争优势，增强其生存和增殖能力。

值得注意的是，Clade-A和Clade-B成员偶尔在同一CAMA内作为混合群落出现，表明这些聚集体内存在代谢互补的潜力。这种共现表明可能存在协同相互作用，其中Clade-A可能细胞外分解淀粉等复杂碳水化合物，为两个分支提供更简单的糖如麦芽糖。反过来，Clade-B可能通过利用果糖等其他碳源贡献整体代谢多样性。

虽然这些特征与互惠功能一致，特别是在稳定的环境条件下，但在压力下（如热暴露和/或营养失衡），宿主-微生物互作的性质可能会发生转变。在这些情况下，高营养清除活性或Endozoicomonas的持续定殖可能给宿主带来代谢成本，使互作向寄生关系倾斜。

未来的研究应旨在通过实验测试这些环境依赖性的结果。了解这种关系何时变得有益或有害对于评估Endozoicomonas在珊瑚健康和恢复力中的作用至关重要。此外，最近获得的A. loripes基因组为研究宿主-微生物代谢互补性提供了新的机会，特别是在营养同化途径方面。比较分析也可能有助于揭示珊瑚宿主是否有能力区分Endozoicomonas分支，例如识别分支特异性表面分子的先天免疫受体。将宿主基因组数据纳入未来的工作可以提供更完整的珊瑚-微生物共生进化动态和分子调控图景。

最后，未来的研究应探索Endozoicomonas介导的营养循环（包括简单糖和磷同化）的推定有益功能，及其在稳态和热诱导营养限制期间对宿主和/或虫黄藻动态的潜在影响。这可能包括评估参与磷获取的基因表达，如那些编码无机磷酸盐和甘油转运蛋白、细胞外磷酸酶、核酸酶和酯酶的基因。