单细胞RNA测序揭示BCG治疗无效的非肌层浸润性膀胱癌中CD6/ALCAM介导的免疫抑制通路

本研究针对BCG治疗高复发率的非肌层浸润性膀胱癌，通过单细胞转录组和全外显子测序技术，发现复发肿瘤中T细胞与尿路上皮细胞间CD6/ALCAM信号通路显著增强，且CD6高表达T细胞呈现功能抑制状态。独立队列验证显示该通路与较短的无复发生存期显著相关（p=0.00059），为增强BCG疗效提供了新的治疗靶点。

　　

膀胱癌是全球常见恶性肿瘤，其中非肌层浸润性膀胱癌（NMIBC）占新发病例的多数。卡介苗（BCG）膀胱灌注是目前中高危NMIBC患者降低复发和进展的金标准疗法，但临床数据显示高达50%的患者会出现疾病复发，这使得探索BCG耐药机制和改进治疗策略成为迫切需求。

尽管既往基于批量测序的研究对BCG耐药的基因突变、拷贝数变异和转录特征提供了部分见解，但这些方法分辨率有限，难以阐明BCG治疗后复发所涉及的细胞类型特异性转录组变化及细胞间互作机制。为此，研究团队采用高分辨率的单细胞RNA测序（scRNA-seq）和全外显子组测序技术，对BCG治疗前和治疗后复发的NMIBC肿瘤样本进行深入解析，旨在揭示肿瘤微环境的免疫格局变化及其在BCG耐药中的作用。

本研究由来自克利夫兰诊所免疫治疗与精准免疫肿瘤学中心、Charles River Laboratories、法国里尔大学医院泌尿外科、Broad研究所等多个国际知名研究机构的团队合作完成，成果发表于《npj Precision Oncology》。研究通过对27例样本（来自23例患者）进行单细胞测序，并结合独立大队列验证，发现了一条此前未被重视的免疫抑制通路——CD6/ALCAM信号轴，该通路在BCG治疗后复发肿瘤中显著激活，且与T细胞功能受损和患者预后不良密切相关。

研究人员主要运用了单细胞RNA测序（scRNA-seq）、全外显子组测序、细胞间通信分析（CellChat）、基因集富集分析（GSEA）以及复发生存分析等关键技术。样本来自克利夫兰诊所经 cystoscopically 切除的NMIBC新鲜组织，并辅以10例良性膀胱组织作为对照。独立验证队列使用了Jong等人已发表的包含282例NMIBC患者的RNA测数据集。

细胞类型组成在BCG初治与复发肿瘤中相似

通过单细胞转录组分析，研究发现BCG初治组与复发组在基因组改变和细胞组成上高度相似。常见的NMIBC相关突变如FGFR3、PIK3CA、KMT2D等两组之间无显著差异，细胞比例分析也未见统计学意义上的组成变化。这表明复发并非由明显的基因组变异或细胞比例改变所驱动。

干扰素信号在BCG治疗后跨细胞类型广泛激活

研究团队对复发样本进行了细胞类型层次的差异表达分析，发现炎症相关通路广泛激活，包括干扰素γ（IFNG）信号、干扰素α（IFNA）信号和肿瘤坏死因子α（TNFA）信号。尤其是在IFNG通路中，抗原呈递相关基因（如HLA-A、HLA-B、B2M）显著上调。这一结果在两名配对样本的患者中也得到验证，说明BCG复发伴随免疫激活状态。

CD6/ALCAM T细胞-尿路上皮细胞互作在复发样本中富集并介导T细胞抑制

通过CellChat细胞互作分析发现，复发样本中尿路上皮细胞与T细胞间的通讯显著增强，其中最显著的变化是CD6（位于T细胞）与其配体ALCAM（CD166，表达于尿路上皮细胞）的相互作用。在初治样本中，CD6/ALCAM互作主要见于T细胞与抗原呈递细胞之间，而复发时则转变为T细胞与多个尿路上皮亚群之间的广泛互作。进一步分析显示，高表达CD6的T细胞（CD6^hi）其活化相关基因（如IL2RB、IRF1、TIGIT等）表达下调，表明这类T细胞功能受抑制。

高CD6/ALCAM信号预测BCG治疗后复发

为了验证该通路的临床意义，研究团队在一个包含282例NMIBC患者的独立RNA测序队列中进行分析，发现CD6与ALCAM共同高表达的患者其无复发生存期显著缩短（log-rank检验，p=0.00059）。这表明CD6/ALCAM信号通路不仅在单细胞层面与免疫抑制相关，在群体水平上也是BCG治疗反应的不良预测因子。

本研究通过高分辨率单细胞技术揭示了BCG治疗后的NMIBC复发与CD6/ALCAM信号通路密切相关，该通路增强了T细胞与肿瘤细胞间的抑制性互作，导致T细胞功能失调。独立临床队列分析进一步支持CD6/ALCAM作为预测BCG治疗反应的生物标志物。这一发现为今后针对BCG无效的NMIBC患者开发新的免疫联合治疗策略提供了关键靶点，例如采用抗CD6或抗ALCAM抗体以恢复T细胞功能，从而增强BCG疗效。

尽管研究存在样本量有限、纵向数据不足等局限性，但其整合多组学技术与临床大样本验证的研究策略，为深入探索肿瘤微环境中的免疫逃逸机制提供了范例。论文数据已公开于Gene Expression Omnibus（GSE269877）及dbGaP（phs003742.v1.p1），支持进一步验证与转化研究。