基于基因组学的淡紫紫孢菌特异性分子标记开发及其在土壤定殖监测中的应用研究

本研究针对昆虫病原真菌(EPF)田间应用后难以精准监测的难题，通过纳米孔长读长测序技术解析Purpureocillium lilacinum NCHU-NPUST-175菌株的全基因组，首次开发出基于独特基因组区域(DGRs)的菌株特异性分子标记。研究人员通过比较基因组学分析筛选出10组特异性引物，其中pl_1、pl_8、pl_10引物组可精准检测土壤中低至103分生孢子/克的真菌浓度，为EPF制剂的田间持久性监测提供了高灵敏度技术方案。

　　

在可持续农业发展中，生物防治技术因其环境友好特性备受关注。昆虫病原真菌(Entomopathogenic Fungi, EPF)作为天然杀虫剂，能通过寄生方式控制害虫种群。然而，在实际田间应用中，如何精准监测施用的真菌菌株在环境中的存活状态和持久性，一直是困扰研究者的技术瓶颈。传统形态学鉴定方法难以区分同种真菌的不同菌株，而通用分子标记（如ITS序列）又缺乏菌株级分辨率。这使得评估EPF制剂的田间效果和生态安全性面临巨大挑战。

针对这一难题，Yeh等研究团队在《BMC Genomics》发表了创新性研究成果。他们以对小黑蚊(Forcipomyia taiwana)具有显著致病效果的淡紫紫孢菌(Purpureocillium lilacinum)菌株NCHU-NPUST-175为研究对象，采用牛津纳米孔技术(Oxford Nanopore Technologies, ONT)完成全基因组测序，通过比较基因组学方法开发出菌株特异性分子标记，实现了对土壤中该菌株的高灵敏度检测。

研究人员主要采用了几项关键技术：首先使用纳米孔长读长测序技术获取高质量基因组数据，通过Canu等工具进行组装和抛光；其次采用FunGap等软件进行基因预测和功能注释（包括PHI-base病原-宿主互作基因、antiSMASH次级代谢产物簇、dbCAN3碳水化合物活性酶分析）；最后通过MUMmer全基因组比对识别独特基因组区域(DGRs)，并设计特异性引物。所有实验均以农业来源土壤样本（GPS: 24°07'07.9"N 120°40'39.9"E）为检测基质，确保方法的实际应用性。

基因组组装与特征分析

研究团队成功组装出36.55 Mb的核基因组（包含13个contigs）和23.488 kb的线粒体基因组。该基因组GC含量为58.64%，预测编码14,069个蛋白质基因，基因密度达384.9基因/Mb。与近缘种P. takamizusanense（35.57 Mb）和P. lilacinum PLFJ-1（38.53 Mb）相比，该菌株显示出独特的基因组特征。特别值得注意的是，该基因组含有42个次级代谢产物合成基因簇（包括5个PKS、6个NRPS）和423个碳水化合物活性酶基因（其中GH18几丁质酶家族尤为丰富），这些特征与其昆虫病原特性密切相关。

比较基因组学与DGR识别

通过全基因组比对分析，研究人员鉴定出1,154个未对齐基因组片段（>5,000 bp）。从中随机选择10个DGR区域设计特异性引物（pl_1-pl_10）。实验验证显示所有引物组均能特异性识别目标菌株，其中pl_1、pl_8、pl_10引物组在8次重复测试中表现出最佳特异性，几乎不与近缘菌株（P. lilacinum-NCHU-152和P. takamizusanense菌株）发生交叉反应。

土壤检测性能验证

在土壤检测实验中，常规PCR方法可检测到10⁵分生孢子/克土壤的浓度，而qPCR方法将检测灵敏度显著提升至10³分生孢子/克土壤。特别值得注意的是，在接种14天后，土壤中真菌DNA拷贝数呈现显著增加趋势（p<0.05），表明该菌株在土壤环境中具有繁殖能力。标准曲线分析显示qpl_1和qpl_10引物组效率最高（R²>0.99），而土壤基质对PCR的抑制效应较小（ΔCt值在-1.01至+1.31之间）。

系统发育分析

基于59个核心基因和线粒体基因组14个核心基因的系统发育分析表明，Pl-NCHU-NPUST-175与其它P. lilacinum菌株形成单系群，且与Drechmeria、Hirsutella等线虫病原真菌亲缘关系较近，提示昆虫病原和线虫病原真菌可能具有共同进化起源。

本研究首次完成了淡紫紫孢菌NCHU-NPUST-175菌株的高质量基因组解析，开发出基于全基因组比较的菌株特异性分子标记技术。这些标记不仅能准确区分种内不同菌株，还能在复杂土壤环境中检测低至10³分生孢子/克的真菌浓度，解决了EPF田间监测的技术瓶颈。该研究建立的比较基因组学方法具有普适性，可推广至其它EPF菌株的特异性标记开发，为生物防治制剂的标准化和质量控制提供了重要技术支撑。值得注意的是，研究中发现的真菌在土壤中的增殖现象（接种14天后DNA拷贝数增加）提示该菌株可能具备土壤定殖能力，这对其持续控害效果具有重要积极意义。未来研究可进一步探索这些特异性标记在田间大规模监测中的应用潜力，推动EPF产品的商业化开发和环境可持续利用。