利用长读长测序技术解析Cacna1e剪接变体的潜在功能多样性及其在钙通道功能调控中的意义

为解析电压门控钙通道(VGCC)剪接变体的功能影响，研究人员采用牛津纳米孔长读长测序技术对大鼠丘脑Cacna1e(Cav2.3)剪接变体进行全面鉴定，最终从2110种变体中筛选出154种可能编码功能性通道的变体，发现31种 cassette splicing事件，其中3个外显子(10/19/45)的表达和保守性显著。该研究为理解Cacna1e功能多样性及疾病机制提供了精准转录本目录和优先研究靶点。

　　

电压门控钙通道（Voltage-Gated Calcium Channels, VGCCs）在调控神经元钙离子内流中扮演关键角色，其编码基因CACNA1家族（又称Cavs）的突变与癫痫、偏头痛和精神分裂症等多种神经系统疾病密切相关。然而，人们对VGCCs通过选择性剪接（Alternative Splicing）产生的功能多样性仍知之甚少。尤其是Cacna1e（编码Cav2.3通道α1亚基）作为一个重要成员，其剪接变体在生理和病理过程中的作用尚未系统解析。以往研究多依赖短读长测序技术，难以准确获取全长转录本结构，导致大量剪接变体未被准确注释和功能验证。

为解决这一问题，Shamsuddin A. Bhuiyan、John R. Tyson等研究人员在《BMC Genomics》上发表了一项研究，他们利用牛津纳米孔（Oxford Nanopore Technology, ONT）长读长RNA测序技术，对大鼠丘脑中的Cacna1e基因进行定向扩增和测序，结合生物信息学分析，系统鉴定了该基因的剪接变体，并从中筛选出可能具有功能意义的变异形式。

为开展本研究，作者主要采用了以下几项关键技术：从GAERS（Genetic Absence Epilepsy Rat from Strasbourg）和NEC（Non-Epileptic Control）大鼠丘脑组织提取总RNA；通过基因特异性引物对Cacna1e进行定向扩增；使用Oxford Nanopore MinION平台进行长读长cDNA测序；利用Illumina短读长测序数据校正长读长序列中的剪接位点错误；采用FLAIR流程进行转录本拼接与定量；通过TransDecoder预测开放阅读框（ORF），Conserved Domain Database（CDD）进行蛋白结构域注释；使用PhastCons和PhyloP进行进化保守性分析；通过BLAST和MaxEntScan评估剪接位点强度与同源性。

研究结果

Cataloging the potential functional diversity of Cacna1e splice variants using long-read sequencing

通过纳米孔测序，研究团队在4个大鼠丘脑样本中共鉴定出2110种Cacna1e剪接变体。进一步分析显示，仅238个变体（11.3%）具有编码超过2000个氨基酸的开放阅读框（ORF），其中154个（占总数7.3%）不仅长度达标，还包含形成功能性钙通道所必需的四个孔道结构域（pore-forming domains）。这些潜在功能性变体占总表达量的61%，其余绝大多数变体可能属于转录“噪音”或技术误差。

Expression profiles of Cacna1e splice variants

表达量分析表明，表达水平最高的四种剪接变体（表达比小于2）占总表达的12.2%、10.7%、8.8%和6.5%。其中排名第一的变体与Soong等人早年报道的rbE-II亚型结构一致，且在成年GAERS和NEC大鼠丘脑中表达最丰富。值得注意的是，Ensembl和RefSeq数据库中原先注释的Cacna1e转录本均未在本次测序数据中匹配到，突显了长读长测序在发现新转录本方面的优势。

Cacna1e splice variants contain a conserved cassette exon 19

在154个优先变体中，共识别出31个Cassette剪接事件（以不同组合出现）。其中三个外显子——10号、19号和45号发生频繁跳跃，分别出现在约40%、40%和45%的测序读段中。这些外显子编码的蛋白区域在进化中高度保守（平均PhyloP分值＞1.3）。通过BLAST和GTEx数据库比对，发现外显子19和45的跳跃事件在包括人类在内的有颌脊椎动物中保守存在，外显子10的跳跃则仅局限于啮齿类。外显子19的跳跃已被文献报道可改变通道失活动力学，外显子45则与癫痫性脑病相关，这提示这些剪接事件可能具有重要功能调节作用。

Novel Cacna1e splicing events

MaxEntScan剪接位点强度分析显示，本研究新发现的Cacna1e变体剪接位点得分中位数高于Ensembl中已注释的转录本，说明新发现的剪接事件可能受到更有效的调控。此外，14个变体缺乏完整的钙调蛋白结合域（GPHH和IQ域），但这些变体表达量极低（最高仅占0.02%），其生物学意义仍需进一步验证。

结论与意义

该研究首次利用长读长测序技术全面解析了大鼠Cacna1e基因的剪接多样性，并建立了一套整合转录本结构、ORF预测、蛋白域注释、进化保守性与表达水平的计算生物学优先级筛选流程。研究表明，尽管Cacna1e可产生多达两千余种剪接变体，但仅有约7%可能编码功能性钙通道，其中外显子10、19、45的选择性剪接最为重要， likely在通道膜运输、失活特性以及疾病相关功能中发挥关键作用。

该研究不仅为Cav2.3通道的功能研究提供了高质量转录本目录，也为系统评估其他离子通道基因的剪接变体功能提供了可推广的方法学框架。未来研究人员可依据该优先级列表展开功能验证实验，进一步揭示Cacna1e在癫痫、疼痛等神经系统疾病中的机制，并为相关药物研发提供新的靶点视角。