非洲疟疾媒介冈比亚按蚊中细胞色素P450基因CYP6P9a/b重复导致线粒体复合物I抑制剂杀虫剂交叉抗性研究及其对疟疾防控的意义

本研究针对拟除虫菊酯抗性导致的疟疾防控困境，揭示了非洲疟疾媒介冈比亚按蚊中细胞色素P450基因CYP6P9a/b的重复不仅介导拟除虫菊酯抗性，还导致新型线粒体复合物I抑制剂杀虫剂Sherlock的交叉抗性。通过CDC瓶测法、WHO锥形瓶法和隧道试验等标准化生物测定，结合基因分型和qRT-PCR分析，发现CYP6P9a_R等位基因携带者存活率显著升高(OR=5.3-18.6)，且表达量上调(FC=24.7-45.6)。这一发现强调了在新型杀虫剂研发早期考虑交叉抗性模式的重要性，为疟疾媒介控制策略提供了关键分子依据。

　　

在热带地区，疟疾依然是一种令人衰弱的重大疾病，2023年导致超过59.7万人死亡，约2.63亿病例。蚊虫媒介控制努力在很大程度上依赖于拟除虫菊酯类杀虫剂，包括室内滞留喷洒和杀虫剂处理蚊帐(ITNs)等干预措施的扩大。然而，拟除虫菊酯抗性的进化和传播正在威胁疟疾控制干预措施的有效性，不仅导致拟除虫菊酯控制干预的失败，还出现了与不相关作用模式杀虫剂的交叉抗性报告，这导致全球疟疾发病率和死亡率降低进展停滞，距离203年至少降低90%的目标相去甚远。

在这一背景下，杀虫剂抗性管理(GPIRM)鼓励制造商或产品开发伙伴关系(如创新媒介控制联盟IVCC)开发含有对媒介控制新型的杀虫剂产品。IVCC成立于2005年，致力于促进新型杀虫剂产品的开发，希望通过管理抗性来维持媒介控制工具的有效性。许多目前用于公共卫生的杀虫剂是从作物保护或动物健康领域转用而来。IVCC还与多家农化公司合作，为媒介控制产品开发新型杀虫剂管道。

随着新型杀虫剂退出开发管道，将其纳入抗性管理策略至关重要。开发一种新型杀虫剂是一项高风险事业，开发成本高，从初步筛选到产品上市的周期长。因此，采取策略检测和筛选出不符合目标产品特征的化合物非常重要，以免在投入大量资源后才发现问题。一种成本效益高的方法是评估感兴趣的新型化合物对拟除虫菊酯抗性媒介株和野生种群的效果，以评估它们所拥有的抗性机制带来的交叉抗性风险。这将通过停止开发某些蚊群已经易受交叉抗性的化合物来节省时间和金钱。

在已知的拟除虫菊酯抗性机制中，由细胞色素P450s(CYPs)上调驱动的代谢抗性更可能赋予对多种化合物的交叉抗性，因为这些酶能够解毒多种底物。这突出了对其他杀虫剂类别(包括线粒体复合物I抑制剂)的交叉抗性风险。Lees等人(2020年)使用体外消耗试验表明，一些复合物I抑制剂杀虫剂高度易受拟除虫菊酯抗性相关CYPs的代谢，如An. gambiae中的CYP6M2和CYP6P3，以及An. funestus中的CYP6P9a。此外，过表达这些CYPs的转基因蚊子死亡率降低，而胡椒基丁醚(PBO)增效剂试验恢复了敏感性，证实了CYP介导的代谢交叉抗性的作用。

最近的研究导致在一些疟疾媒介物种中检测到几种解毒酶抗性的DNA标记，特别是An. funestus。这些标记包括来自串联重复的P450基因CYP6P9a/b的标记，通过等位基因变异和过表达显示赋予拟除虫菊酯抗性。此外，还检测到与CYPs表达增强相关的结构变异(SV)，包括CYP6P9a启动子区域的6.5 kb插入，为检测CYP介导的抗性及其在交叉抗性中的作用提供了进一步的方法，如最近对氨基甲酸酯所示。

本研究旨在建立拟除虫菊酯抗性田间采集和实验室株对一种新型线粒体复合物I抑制剂杀虫剂(代号Sherlock)的敏感性谱。使用CDC瓶试验、WHO锥形瓶试验和WHO隧道试验评估了Sherlock(活性成分和杀虫剂处理蚊帐中)的功效。使用先前建立的基于DNA的拟除虫菊酯抗性标记评估了这些试验中产生的拟除虫菊酯抗性株的抗性和交叉抗性的分子基础。

主要技术方法包括：使用CDC瓶试验、WHO锥形瓶试验和WHO隧道试验三种标准化生物测定法评估田间和实验室株对拟除虫菊酯和Sherlock杀虫剂的敏感性；对生物测定生成的样本进行基因分型分析(包括L119F-GSTe2、6.5 kb SV、CYP6P9a和CYP6P9b抗性标记)；通过qRT-PCR分析代谢基因的表达水平；使用来自喀麦隆的田间种群(Nkolondom的An. gambiae s.s.和Mibellon的An. funestus s.s.)和实验室株(高度拟除虫菊酯抗性的FUMOZ-R株及其与完全杀虫剂敏感实验室FANG株杂交产生的F₄代杂交株)。

susceptibility profile of mosquito strains

通过CDC瓶试验发现，来自喀麦隆的田间An. gambiae s.s.和An. funestus s.s.株对Sherlock完全敏感，而在FUMOZ-R An. funestus实验室株中观察到中等抗性。杂交蚊子的基因型分析表明，拟除虫菊酯抗性标记与对Sherlock的敏感性降低相关。携带一个CYP6P9a_R等位基因的个体在暴露于Sherlock后存活几率显著高于缺乏该等位基因的个体，CDC瓶试验(1xDC: OR=5.3, CI=2.7-9.8, p<0.0001; 5xDC: OR=18.6, CI=7.8-46.4, p<0.0001)、锥形瓶试验(OR=5.1, CI=2.7-9.8, p<0.0001)和隧道试验(OR=6.6, CI=3.4-12.6, p<0.0001)均证明了这一点。qRT-PCR分析显示，在暴露于Sherlock和氯菊酯后存活的杂交蚊子中CYP6P9a表达升高，CDC瓶试验(1xDC: FC=24.7; 5xDC: FC=45.6; 氯菊酯: FC=35.4)和锥形瓶试验(FC=9.8; FC=4.8)均观察到这一现象。这些发现与CYP6P9b插入模式一致。L119F_GSTe2拟除虫菊酯抗性标记不赋予对Sherlock的交叉抗性。

Genotyping of pyrethroid-resistant markers

对生物测定生成样本中6.5 kb SV、CYP6P9a和CYP6P9b抗性标记的基因分型表明，这些标记与蚊子存活能力显著相关。携带纯合耐药等位基因的蚊子存活几率最高，且三个标记组合时呈现累加效应。针对PermaNet 2.0和Sherlock蚊帐的WHO锥形瓶试验显示，这些标记与蚊帐生物功效降低显著相关。

WHO tunnel tests

WHO隧道试验进一步评估了这些抗性标记对蚊子存活和吸血能力的影响。研究发现，携带纯合耐药等位基因的蚊子不仅更容易在杀虫剂暴露后存活，而且更可能成功穿透蚊帐屏障并吸血后存活，这增加了疟疾传播的风险。

The expression levels of metabolic genes

qRT-PCR分析证实，CYP6P9a和CYP6P9b的过表达与拟除虫菊酯抗性和Sherlock交叉抗性相关。在CDC瓶试验中，暴露于杀虫剂的蚊子显示这些基因显著上调，而在WHO锥形瓶试验中，由于暴露时间短，未能检测到这种诱导表达。

研究结论表明，拟除虫菊酯抗性相关CYP基因(特别是CYP6P9a/b)的过表达不仅介导对拟除虫菊酯的抗性，还导致对新型线粒体复合物I抑制剂杀虫剂Sherlock的交叉抗性。这种交叉抗性现象在实验室株中明显，而在喀麦隆田间种群中尚未发现，因为这些抗性标记在这些种群中不存在。研究发现，携带CYP6P9a_R等位基因的蚊子存活几率显著增加，且基因表达量明显上调。

这一发现对疟疾媒介控制具有重要意义：首先，它强调了在新型杀虫剂研发早期评估交叉抗性风险的重要性，以避免资源浪费；其次，研究表明Sherlock杀虫剂在缺乏这些抗性标记的地区可能仍然有效；第三，为了最大化Sherlock蚊帐配方的效用，可能需要与增效剂PBO共同配方；最后，研究证实了将标准化生物测定与分子诊断相结合作为一种成本效益高的策略，在早期开发阶段评估杀虫化合物的生物功效和交叉抗性脆弱性的实用性。

这些发现不仅阐明了关键拟除虫菊酯抗性相关CYP基因(CYP6P9a/b)在降低对新型杀虫剂Sherlock敏感性中的关键作用，而且强调了在新型杀虫剂研发和部署中考虑交叉抗性模式的重要性，为疟疾媒介控制的抗性管理策略提供了重要科学依据。