牛津纳米孔长读长测序在环境宏基因组学中的自动化应用：提升效率与重现性的关键研究

本研究针对环境宏基因组学中长读长测序（ONT）自动化建库流程的验证需求，通过对比手动与自动化（Bravo平台）方法，证实自动化建库在保持微生物群落结构一致性的同时，提升了稀有物种检出率和分类效率，为高通量、高重现性宏基因组研究提供了关键技术支持。

　　

随着长读长测序技术的快速发展，牛津纳米孔（Oxford Nanopore Technologies, ONT）和太平洋生物科学（Pacific Biosciences, PacBio）平台显著提升了宏基因组组装、分类和功能注释的精度。然而，在复杂环境样本（如土壤）的高通量测序中，手动建库过程存在操作步骤繁琐、人为误差风险高以及样本间变异大等问题，严重限制了研究的重现性和规模化应用。尽管自动化液体处理系统（如Bravo平台）在扩增子测序领域已得到初步验证，但其在敏感度高的全基因组宏基因组流程中的适用性仍未明确。

为系统评估自动化建库对长读长测序宏基因组分析的影响，Harry T. Child等人开展了针对不同生境土壤样本的平行实验，比较手动与自动化（Bravo Automated Liquid Handling Platform）建库方法在测序质量、分类效能和生态学分析等多个维度的表现。该研究近日发表于《BMC Genomics》，为自动化长读长测序在环境微生物研究中的推广提供了扎实的数据支持。

本研究采用来自四种不同生境（包括林地、草地等）的土壤样本，经DNeasy? PowerSoil? Pro Kit提取DNA后，分别通过手动和Bravo自动化平台完成ONT Ligation Sequencing Kit（SQK-LSK114）与PCR Barcoding Expansion 96（EXP-PBC096）建库，并在同一PromethION流动槽（R10.4.1）上进行测序。后续数据分析包括：使用Guppy v7.1.4进行碱基识别与解复用，MetaFlye进行宏基因组组装，Kraken2基于NCBI nr数据库完成分类学注释，SemiBin2和CheckM2用于宏基因组组装基因组（MAGs）的拼接与质量评估，并使用vegan包进行生态统计与Bray-Curtis距离计算。

结果分析

测序读段指标比较

自动化建库虽导致读长和重叠群（contig）长度略有下降（平均读长减少756 bp，N50降低785 bp），但在测序深度与读段质量（Q20）方面无显著差异。值得注意的是，自动化建库反而呈现出略高的分类注释率（平均提高0.5%）和α多样性指数，表明确保了数据质量的同时，提升了物种检测灵敏度。

宏基因组组装基因组（MAGs）生成

多数样本中MAGs的获得数量有限（65%的样本中仅生成0–1个中等质量MAG），但手动建库在中等质量MAG的数量上显著占优，尤其是在健康土壤样本中表现突出。这一差异可能与土壤类型特性及读长分布有关，说明在极高测序深度要求下（如>20 Gbp/样本），手动方法仍具有一定优势。

微生物群落结构分析

在科（Family）水平上，自动化建库显示出更高的香农-维弗指数和物种丰富度，主要体现在稀有类群的检出上。然而，Bray-Curtis距离与PERMANOVA分析表明，土壤类型是群落结构变异的主要因素（R2 = 0.92, p < 0.001），而建库方法无显著影响。不同土壤类型内部分析进一步验证了自动化与手动方法在群落结构方面的高度一致性。

结论与意义

本研究证实，尽管自动化建库可能导致读长轻微缩短和MAGs生成数量有限度减少，但其在微生物群落结构表征、稀有物种检出及分类一致性方面与手动方法无显著差异，具备优异的重现性与可靠性。自动化流程大幅减少了人工操作时间与误差，为大规模环境宏基因组项目（如土壤微生物调查、生态功能研究等）提供了高效、标准化解决方案，极大推动了长读长测序技术在微生物生态学中的应用前景。