西方蜜蜂多组织基因表达分析中内参基因的筛选与验证及其在发育阶段和亚种间的稳定性研究

本研究针对西方蜜蜂(Apis mellifera)在多组织(触角、王浆腺和大脑)和不同发育阶段(新出房蜂、哺育蜂和采集蜂)基因表达定量中缺乏稳定内参基因的问题，系统评估了9个候选内参基因在两个亚种(A. m. ligustica和A. m. carnica)中的表达稳定性。通过五种算法综合分析发现arf1和rpL32表达最稳定，而传统看家基因(α-tubulin、gapdh和β-actin)稳定性较差。该研究为蜜蜂发育可塑性、社会行为和产浆性状相关基因的精确定量提供了重要技术支撑。

　　

在昆虫学研究领域，西方蜜蜂(Apis mellifera)作为社会性昆虫的典型代表，其复杂的社会组织和令人惊叹的表型可塑性一直吸引着科学家们的关注。在蜂群中，工蜂的行为专业化表现为明显的劳动分工：新出房蜂负责清理巢房，青年工蜂发育成为用王浆腺分泌蜂王浆的哺育蜂，而中年工蜂则转变为外出采集的采集蜂。这种行为转变伴随着显著的生理和分子适应，特别是在感觉器官和分泌组织中。

研究人员发现，哺育蜂的王浆腺发达且分泌活性强，触角对幼虫和蜂王信息素更加敏感；而采集蜂的王浆腺退化，触角则对花蜜和花粉更敏感。大脑作为中枢神经系统的调控中心，在行为编程中起着关键作用。这些组织中的基因表达差异被认为与任务特异性行为的执行直接或间接相关。此外，在高产浆品系(意大利蜜蜂A. m. ligustica)中，这些组织在全球基因表达谱上的适应性变化被认为与蜂王浆分泌的增加有关。

准确量化这些特异性组织中的基因表达水平对于阐明蜜蜂发育可塑性、行为转变和差异生产性能的分子机制至关重要。实时定量PCR(RT-qPCR)是目前最灵敏、可靠的mRNA表达水平检测和定量方法，但该技术需要系统标准化以消除初始mRNA输入量和质量以及PCR扩增或cDNA合成效率的变异。使用表达稳定的内参基因仍然是主要的标准化方法，但常用内参基因在不同实验条件下往往表现不稳定。

虽然此前研究已经鉴定出一些在蜜蜂中稳定的内参基因，如适用于季节变化的rpS5和rpS18、农药处理下的rab1和arf1，以及发育阶段的rab1，但这些发现主要基于全身标本或体段(头、胸、腹)，可能掩盖了这些内参基因的组织特异性表达变异。事实上，新出房蜂王的研究已经证明了内参基因转录水平存在显著的组织特异性变异。

在蜜蜂特异性组织(触角、王浆腺和大脑)中进行基因表达定量已被广泛用于研究发育可塑性、劳动分工和蜂王浆生产的差异性能。这类研究经常使用常见内参基因(如actin、gapdh和α-tub)进行标准化而没有稳定性验证，从而影响了基因表达定量的可靠性。

为解决这一空白，中国农业科学院蜜蜂研究所的研究人员在《BMC Genomics》上发表了他们的研究成果，系统评估了九个候选内参基因在两个蜜蜂亚种(A. m. ligustica和A. m. carnica) across 成虫发育阶段(新出房蜂、哺育蜂和采集蜂)和组织(触角、王浆腺和大脑)中的表达稳定性。

研究人员主要采用了实时定量PCR(RT-qPCR)技术，使用五种统计算法(geNorm、NormFinder、BestKeeper、ΔCT方法和RefFinder)评估基因稳定性，并通过标准化major royal jelly protein 2(mrjp2)的表达模式进行实验验证。样本来自中国农业科学院蜜蜂研究所蜂场饲养的卡尼鄂拉蜂(A. m. carnica)和高产浆品系(从意大利蜜蜂A. m. ligustica选育而来)，包括新出房蜂、哺育蜂和采集蜂三个发育阶段。

候选内参基因的引物评价

研究人员首先通过1.5%琼脂糖凝胶电泳验证了所有候选内参基因PCR产物的扩增特异性，结果显示每个基因都观察到预期大小的单一条带。

。所有候选内参基因在建立的标准曲线中都具有高线性回归系数(R²>0.990)和扩增效率(92.1%-114.5%)，表明设计的引物具有高特异性和效率。

候选内参基因的表达模式

对候选内参基因在不同条件下的表达进行分析显示，actin表达水平最高，平均C_T值为17.01，而α-tub表达水平最低，平均C_T值为23.78。α-tub、actin和gapdh的C_T值变异最大，C_T范围分别为9.62、9.45和9.12，表明这些基因的稳定性最低。相反，arf1、ef1和rab1的C_T范围最小，分别为5.40、6.40和6.96，因而显示出最高的稳定性

。

候选内参基因的稳定性分析

通过五种算法综合分析基因表达稳定性：BestKeeper鉴定ef1和arf1为最稳定的两个基因；geNorm显示rpL32是最稳定的参考基因；NormFinder分析表明arf1稳定性最高；ΔC_T方法确定arf1为最稳定基因；RefFinder整合排名显示arf1和rpL32为两个最稳定的参考基因。

。

为确定最佳内参基因数量，通过geNorm计算 pairwise variation(V_n/V_n+1)值，V₄/V₅值(0.142)低于 cutoff 值0.15，表明在当前实验条件下，使用四个内参基因组合适合准确标准化。

。

内参基因的验证

为验证所选内参基因的表达稳定性，使用两个最稳定(arf1和rpL32-1)和两个最不稳定(α-tub和gapdh)的内参基因分别标准化mrjp2在意大利蜜蜂王浆腺不同发育阶段的表达。使用arf1或rpL32-1作为内参基因时，mrjp2在哺育蜂中表达水平较高，与先前发现一致。然而，使用gapdh或α-tub标准化后，mrjp2表达水平变异较大。使用gapdh标准化时，未能恢复mrjp2在哺育蜂中相对于采集蜂的显著较高表达水平。

。

研究结论表明，arf1是在两个蜜蜂亚种、三个组织和三个发育阶段的所有实验条件下最稳定的内参基因，可作为这些条件下基因表达标准化的最佳单一内参基因。rpL32是第二稳定的内参基因，其高稳定性通过mrjp2表达标准化和使用两对引物的相似排名位置得到确认。

值得注意的是，传统看家基因包括α-tub、gapdh和actin在所有测试算法中始终排名最后三位，被认为是最不稳定的内参基因。这些基因在蜜蜂中的表达稳定性缺乏已在各种处理和条件下被报道，如不同发育阶段、农药处理以及dsRNA和CSBV感染处理。

该研究的重要意义在于为蜜蜂组织特异性发育、行为可塑性和亚种间蜂王浆生产差异相关的基因表达研究提供了可靠的标准化工具。这些内参基因的鉴定将有助于准确识别与蜜蜂发育、社会行为和生产力性状相关的候选基因，推动蜜蜂生物学和农业应用的进一步发展。

研究人员强调，尽管在目前实验条件下推荐使用四个内参基因组合进行标准化，但使用其中一个最稳定的内参基因(arf1或rpL32)进行标准化是有效的，它们可以作为当前实验条件下的最佳单一内参基因。同时，研究者提醒在使用这些内参基因进行蜜蜂目标基因表达标准化时需要更加谨慎，至少对于本研究分析的发育阶段和组织是如此。