基于酿酒酵母表达系统的新型重组ROP6蛋白疫苗显著诱导免疫应答并提供抗弓形虫病保护效果

本研究针对慢性弓形虫病缺乏有效防治手段的难题，开发了基于弓形虫棒状体蛋白ROP6的重组亚单位疫苗。研究人员通过酿酒酵母INVSc1细胞表达系统成功制备重组rROP6蛋白，并联合弗氏佐剂免疫BALB/c小鼠。实验结果表明，该疫苗能激发强烈的IgG抗体反应和CD8+ T细胞免疫应答，攻毒实验显示免疫组小鼠全部存活，脑组织内包囊数量和虫体DNA载量显著降低（P<0.0001）。该研究为开发安全有效的人畜共患弓形虫病疫苗提供了重要实验依据。

　　

弓形虫（Toxoplasma gondii）是一种能感染几乎所有温血动物和人类的专性细胞内寄生虫，引起的弓形虫病不仅导致严重的健康问题，还造成畜牧业重大经济损失。更为棘手的是，目前尚无针对慢性弓形虫病的有效药物治疗方案，而现有治疗急性感染的药物存在毒性强、副作用大且易产生耐药性等问题。全球范围内，唯一商业化的弓形虫疫苗ToxoVax仅用于预防绵羊流产，且存在有效期短、成本高和潜在毒力恢复风险等局限性。因此，开发安全有效的新型疫苗成为防治弓形虫病的迫切需求。

在这项发表于《Scientific Reports》的研究中，土耳其埃杰大学疫苗研发应用研究中心的Tugba Karakavuk等研究人员将目光投向弓形虫的棒状体蛋白（rhoptry proteins, ROP）——这类在虫体入侵宿主细胞、穿透细胞膜以及形成纳虫空泡（parasitophorous vacuole）过程中起关键作用的毒力因子。特别值得注意的是，ROP6蛋白在前期蛋白质微阵列筛选中显示出高度免疫原性，且在虫体感染早期的孢子体和速殖子阶段高表达，提示其作为疫苗靶点的巨大潜力。

研究团队采用多种关键技术方法开展系统研究：通过生物信息学分析对ROP6蛋白进行理性设计，利用酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）INVSc1真核表达系统进行重组蛋白表达，采用AKTA-FPLC色谱系统和镍柱亲和层析进行蛋白纯化，通过Western blot和ELISA评估体液免疫应答，借助流式细胞术和细胞因子ELISA分析细胞免疫反应，最后使用显微镜计数和qPCR技术（靶向T. gondii RE基因）评估疫苗对PRU株组织包囊攻击的保护效果。

In silico analysis of ROP6 protein

通过生物信息学分析发现，全长ROP6蛋白（480个氨基酸，51.4 kDa）不稳定且不溶性高。研究人员截去了跨膜区（455-477 aa）和细胞内结构域（478-480 aa），最终选择了包含3个B细胞表位、5个MHC-I表位和1个MHC-II表位的2-156氨基酸区域，并在N端添加丝氨酸和缬氨酸以提高稳定性，最终获得理论分子量为22.15 kDa的可溶性重组蛋白设计。

rROP6 protein expression in S. cerevisiae and purification

研究成功在酿酒酵母INVSc1细胞中表达并纯化了rROP6蛋白。SDS-PAGE和Western blot分析显示，实际获得的蛋白分子量约为27 kDa，比理论值大，推测是由于酵母系统中的翻译后修饰所致。

Humoral immune response

Western blot分析表明，rROP6+Freund免疫组小鼠血清中存在特异性抗rROP6 IgG抗体，且这些抗体能识别天然弓形虫裂解抗原中的约51.4 kDa蛋白条带。ELISA结果显示，rROP6+Freund免疫组小鼠的抗rROP6 IgG水平显著高于对照组（P<0.01）。

Cellular immune response

细胞因子检测显示，rROP6+Freund免疫组小鼠脾细胞在rROP6蛋白刺激后产生更高水平的IFN-γ（P<0.05），而IL-4水平无显著变化。流式细胞术分析进一步证实，rROP6+Freund免疫组中分泌IFN-γ的CD8⁺ T细胞和CD4⁺ T细胞比例显著高于对照组（P<0.05），而分泌IL-4的CD4⁺ T细胞比例无显著差异。

Protective efficacy against T. gondii PRU strain

攻毒实验结果显示，rROP6+Freund疫苗提供了100%的保护率，显著高于PBS组（25%，P<0.01）、Freund佐剂组（37.5%，P<0.01）和单独rROP6蛋白组（50%，P<0.05）。显微镜检查发现，免疫组小鼠脑组织包囊数量显著减少（P<0.01）。qPCR结果进一步证实，免疫组脑组织中的弓形虫DNA载量显著低于各对照组（P<0.0001）。

研究结论与讨论部分指出，本研究首次使用酿酒酵母表达系统成功制备了重组ROP6蛋白疫苗，并证明其能诱导强烈的体液和细胞免疫应答，特别是激发CD8⁺ T细胞介导的IFN-γ反应，这对控制细胞内寄生虫感染至关重要。实验结果表明，rROP6+Freund疫苗能显著减少慢性感染阶段脑组织中的包囊数量和虫体DNA载量，提供完全保护作用。

该研究的重要意义在于：首先，采用公认安全的酿酒酵母表达系统（GRAS标准），为疫苗的临床应用奠定了基础；其次，通过理性设计解决了全长ROP6蛋白不稳定和聚集的问题，为其他类似蛋白疫苗开发提供了借鉴；最后，研究证实ROP6作为疫苗靶点的有效性，为开发针对慢性弓形虫病的高效亚单位疫苗提供了新策略。

这项研究不仅为弓形虫疫苗研发提供了新的候选抗原和技术平台，也为其他寄生虫病疫苗的研制提供了重要参考。未来研究可进一步优化佐剂系统，探索不同接种途径，并评估疫苗在不同动物模型中的保护效果，最终推动其向临床应用转化。