番茄红素增强猪体细胞核移植胚胎的表观遗传重编程和合子基因组激活

本研究针对猪体细胞核移植(SCNT)胚胎发育效率低下的问题，通过添加番茄红素(Lycopene)进行体外培养(IVC)，发现0.2μM浓度可显著提高胚胎发育质量和表观遗传重编程效率，降低氧化应激和异常甲基化水平，为改善克隆胚胎发育提供了新策略。

　　

在生物医学研究和畜牧育种领域，猪因其与人类相似的解剖结构、生理特征和遗传背景，成为不可替代的大型动物模型。通过体细胞核移植(SCNT)技术制备基因工程猪，不仅可用于人类疾病机制研究和药物筛选，还在异种器官移植方面展现出巨大潜力。然而，SCNT技术的应用始终面临一个关键瓶颈：克隆胚胎发育效率极低，绝大多数胚胎在早期发育阶段就会停滞。

导致SCNT胚胎发育失败的主要原因可归结为两个方面。首先是表观遗传重编程的不完全性。当体细胞核被移植到去核卵母细胞后，需要抹去体细胞特异的"表观遗传记忆"，重新获得类似受精卵的全能性状态。这个过程涉及DNA甲基化(5mC)、组蛋白修饰(如H3K4me³、H3K9me³)等多种表观遗传标记的重置。然而，SCNT胚胎中这些标记往往异常滞留，形成了重编程的"表观遗传屏障"。其次是合子基因组激活(ZGA)的不足。ZGA是胚胎发育过程中从母源性基因表达转向胚胎自身基因表达的关键转折点，在猪胚胎中通常发生在4-5细胞阶段。SCNT胚胎由于不完全的重编程，往往无法正常启动ZGA，导致发育阻滞。

此外，体外培养(IVC)过程中产生的高水平活性氧(ROS)也会加剧SCNT胚胎的发育困难。氧化应激不仅直接损伤细胞结构和DNA，还会干扰正常的表观遗传修饰过程，形成恶性循环。尽管研究人员已经尝试使用多种抗氧化剂如褪黑素、维生素C和虾青素来改善这一状况，但效果仍有局限。番茄红素作为一种强效的类胡萝卜素抗氧化剂，其在猪SCNT胚胎中的作用尚未明确。

为了解决这一难题，韩国生物科学与生物技术研究所和韩国国立韩京大学的研究团队开展了一项创新性研究，系统探讨了番茄红素对猪SCNT胚胎发育的影响及其作用机制。研究人员通过一系列精心设计的实验，揭示了番茄红素如何通过多途径协同作用，突破SCNT胚胎发育的瓶颈。该研究成果近期发表在《Scientific Reports》期刊上，为提高动物克隆效率和胚胎质量提供了新的理论依据和实践方案。

本研究主要采用了以下几种关键技术方法：使用屠宰场收集的猪卵巢获取卵母细胞，进行体外成熟(IVM)培养；通过孤雌激活(PA)和体细胞核移植(SCNT)构建实验胚胎模型；采用不同浓度番茄红素(0、0.02、0.2、2μM)进行全程体外培养(IVC)；通过TUNEL检测分析细胞凋亡情况；利用荧光探针(CM-H2DCFDA、JC-1)检测细胞内ROS水平和线粒体膜电位；使用免疫荧光染色技术分析组蛋白修饰(H3K4me³、H3K9me³、H3K9ac)和DNA甲基化(5mC)水平；通过qRT-PCR技术检测抗氧化酶、表观遗传调控因子和ZGA相关基因的表达水平。

Effects of lycopene on the development of porcine PA embryos

研究人员首先通过孤雌激活(PA)胚胎模型筛选番茄红素的最佳作用浓度。他们将PA胚胎分别在含有0、0.02、0.2和2μM番茄红素的培养液中进行全程培养，结果发现0.2μM浓度效果最为显著。该浓度不仅提高了第2天4-5细胞阶段的卵裂比例，还显著提升了第6天的囊胚形成率。

更重要的是，番茄红素处理还显著改善了胚胎质量。0.2μM处理组的凋亡细胞数量和凋亡率显著降低，总细胞数和滋养层(TE)细胞数明显增加，虽然内细胞团(ICM)细胞数没有显著变化。这表明番茄红素主要通过促进滋养层发育来提高胚胎质量。

Effects of lycopene on the development of porcine SCNT embryos

在确定最佳浓度后，研究人员进一步在SCNT胚胎中验证番茄红素的效果。与PA胚胎结果一致，0.2μM番茄红素处理显著提高了SCNT胚胎在第2天的4-5细胞阶段比例和第6天的囊胚形成率。

同时，番茄红素处理显著降低了SCNT囊胚的凋亡率和凋亡细胞数，增加了总细胞数和TE细胞数，而对ICM细胞数没有明显影响。这些结果证实了番茄红素对SCNT胚胎发育的促进作用。

Effects of lycopene on intracellular ROS and antioxidant enzyme-related gene expression levels in porcine SCNT embryos

为了探究番茄红素的作用机制，研究人员首先检测了其对氧化应激的影响。结果显示，0.2μM番茄红素处理显著降低了SCNT 4细胞胚胎和囊胚中的细胞内ROS水平。

在基因表达水平，番茄红素处理上调了抗氧化酶相关基因(CAT、SOD1、SOD2和HO-1)的表达，同时降低了凋亡相关基因BAX与BCL2L的比值。在PA胚胎中也观察到了类似的变化趋势。这表明番茄红素通过增强胚胎的抗氧化防御系统来减轻氧化应激。

Effects of lycopene on mitochondrial membrane potential and autophagy in porcine SCNT 4-cell embryos

线粒体功能和自噬在早期胚胎发育中起着关键作用。研究人员通过JC-1染色发现，番茄红素处理显著提高了SCNT 4细胞胚胎的线粒体膜电位(红绿荧光比值增加)，表明线粒体功能得到改善。

同时，自噬检测显示番茄红素处理增加了自噬活性(绿色荧光强度增加)。在PA胚胎中也观察到了类似的线粒体功能改善和自噬活性增加。这些结果表明番茄红素通过改善线粒体功能和促进自噬来支持胚胎发育。

Effects of lycopene on epigenetic modifications, such as histone and DNA methylation, in porcine SCNT 4-cell embryos and blastocysts

表观遗传重编程是SCNT胚胎发育的关键环节。研究人员通过免疫荧光染色发现，番茄红素处理显著降低了SCNT囊胚中的H3K4me³水平，虽然在4细胞阶段变化不显著。在PA胚胎中，H3K4me³水平在4细胞胚胎和囊胚阶段均显著降低。

更重要的是，番茄红素处理显著降低了SCNT和PA胚胎中H3K9me³的水平(在4细胞胚胎和囊胚阶段均有效)，同时增加了H3K9ac水平。此外，DNA甲基化标记5mC的水平在SCNT 4细胞胚胎和囊胚中显著降低，在PA囊胚中也观察到类似降低。

在分子机制上，番茄红素处理下调了组蛋白甲基转移酶相关基因(ASH2L和SUV39H2)和DNA甲基转移酶相关基因(DNMT1、DNMT3A和DNMT3B)的表达。这些结果首次证明番茄红素能够调控多种表观遗传修饰，促进SCNT胚胎的表观遗传重编程。

Effects of lycopene on ZGA-related gene expression levels in porcine embryos

最后，研究人员检测了番茄红素对合子基因组激活(ZGA)的影响。qPCR结果显示，在SCNT 4细胞胚胎中，番茄红素处理显著上调了ZGA相关基因(ZSCAN4、UBTFL1、SUPT4H1、MYC和ELOA)的表达，其中MYC表达增加了两倍以上。

在PA 4细胞胚胎中也观察到了类似的变化趋势。这些结果表明番茄红素通过减轻氧化应激、增强线粒体功能、促进自噬和改善表观遗传重编程，最终成功激活了ZGA，提高了胚胎发育能力。

本研究系统阐明了番茄红素在猪SCNT胚胎发育中的多重益处及其作用机制。通过在体外培养过程中添加0.2μM番茄红素，研究人员显著提高了PA和SCNT胚胎的发育指标，包括4-5细胞卵裂率、囊胚形成率以及总细胞数和滋养层细胞数。

番茄红素的作用机制涉及多个方面：首先，它有效降低了细胞内ROS水平，增强了抗氧化防御系统；其次，它改善了线粒体膜电位和功能，增加了自噬活性；最重要的是，番茄红素调控了多种表观遗传修饰，包括降低H3K4me³、H3K9me³和5mC水平，增加H3K9ac水平，并下调相关甲基转移酶基因的表达。这些变化共同创造了一个更有利于重编程的染色质环境，最终成功激活了ZGA相关基因的表达。

该研究的发现不仅深化了我们对SCNT胚胎发育障碍机制的理解，还为提高动物克隆效率提供了切实可行的策略。番茄红素作为一种天然抗氧化剂，具有安全性高、成本相对较低的优点，在畜牧育种和生物医学研究领域具有广阔的应用前景。未来研究可进一步探索番茄红素与其他抗氧化剂或表观遗传调控剂的联合使用效果，以及其在不同物种SCNT中的应用价值。