Karanjin通过抑制乙酰胆碱酯酶和氧化损伤保护双酚A诱导的斑马鱼认知缺陷的作用机制研究

《Scientific Reports》：Protective role of Karanjin against bisphenol A-Induced cognitive deficits and oxidative damage in a zebrafish model

本研究针对环境污染物双酚A(BPA)诱导的神经毒性问题，开展了天然呋喃黄酮Karanjin的神经保护作用机制研究。通过21天斑马鱼模型实验发现，10 mg/L Karanjin能显著逆转BPA引起的认知功能障碍，降低乙酰胆碱酯酶(AChE)活性，恢复谷胱甘肽(GSH)水平和超氧化物歧化酶(SOD)活性，减少脂质过氧化(LPO)。组织病理学证实Karanjin能有效保持神经元完整性，其效果与FDA批准药物多奈哌齐和mentat相当，为神经退行性疾病治疗提供了新型天然候选药物。

　　

在现代工业社会中，双酚A(BPA)作为一种广泛使用的工业化合物，已成为无处不在的环境污染物。这种具有内分泌干扰特性的持久性环境污染物，与神经毒性、认知功能下降、突触功能障碍和神经元变性密切相关。BPA能够穿过血脑屏障，诱导氧化应激、线粒体功能障碍和神经炎症，最终导致阿尔茨海默病(AD)等神经退行性疾病。全球BPA使用量预计到2030年将达到1198万吨，其中90%的人类日常暴露来自食品和饮料容器，5-7%来自ATM和购物收据中的热敏纸，3-5%来自灰尘、化妆品和医疗产品。许多人 unknowingly 摄入的BPA远远超过欧洲食品安全局0.2 ng/kg bw/day的安全限值，这比2006年的50μg/kg和2015年的4μg/kg标准降低了20,000倍，反映出日益增长的健康担忧。

目前，全球有超过5000万人患有AD，预计到2030年将增至8200万人，2050年达到1.52亿人。尽管FDA批准的药物如美金刚和胆碱酯酶抑制剂（多奈哌齐、加兰他敏和利斯的明）能够缓解症状，但会引起恶心、眩晕和意识模糊等副作用。最近批准的抗淀粉样蛋白药物如lecanemab、aducanumab和donanemab虽然靶向淀粉样斑块，但与淀粉样蛋白相关影像学异常(ARIA)和头痛等副作用相关。因此，开发更安全有效的 therapies 迫在眉睫。

传统药物的复兴因其整体性方法、感知安全性和文化相关性而受到重视，为现代药物的不良反应提供了替代方案。随着全球兴趣的增长，传统药物市场预计到2030年将显著扩张，这需要通过科学验证和标准化来确保安全性和有效性。黄酮类化合物作为一类重要的植物化学物质，已通过调节氧化应激和炎症通路证明具有神经保护作用。其中，从水黄皮(Pongamia pinnata)中提取的Karanjin表现出强大的抗氧化、抗炎和神经保护特性。Karanjin的药理特性不仅限于神经保护，还包括抗癌、抗糖尿病、抗溃疡、抗结肠炎、肝保护和护肤（包括抗痤疮效果）等多种功效。

尽管分子对接研究显示Karanjin对AD和帕金森病具有潜在治疗价值，但缺乏全面的体内验证。为了填补这一空白，研究人员利用斑马鱼模型进行了体内研究，评估Karanjin对BPA诱导的神经毒性的保护作用。该研究旨在进一步阐明Karanjin的治疗潜力，特别是其减轻氧化应激和神经退行性过程的能力，从而为更安全有效的AD治疗提供新途径。

本研究主要采用了以下关键技术方法：使用成年斑马鱼（13周龄）进行21天静态浸泡暴露实验；通过卤虫致死性试验评估化合物安全性；运用新型水箱潜水测试(NTDT)、T迷宫、新物体识别(NOR)和Y迷宫等行为学分析评估认知功能；采用Ellman法测定乙酰胆碱酯酶(AChE)活性；通过硫代巴比妥酸反应物质(TBARS)法检测脂质过氧化(LPO)；使用DTNB法测定谷胱甘肽(GSH)水平；采用氮蓝四唑(NBT)法分析超氧化物歧化酶(SOD)活性；通过苏木精-伊红(H&E)染色进行组织病理学评估。

Brine shrimp lethality assay

通过卤虫致死性试验发现，Karanjin的LC₅₀值为333.33μg/mL，而标准神经保护剂多奈哌齐和mentat的LC₅₀值分别为360.81μg/mL和361.04μg/mL。阳性对照重铬酸钾的LC₅₀为8.02μg/mL。根据Logarto Parra等人建立的相关性，LC₅₀值>25μg/mL的化合物对应的LD₅₀范围在2500-8000 mg/kg之间，表明Karanjin具有显著的生物活性和明确的安全边际。

Acute toxicity of Karanjin

根据OECD Test Guideline 203进行的急性毒性评估显示，Karanjin在斑马鱼中表现出剂量依赖性毒性特征。较高浓度（100 mg/L和50 mg/L）在24小时内导致100%死亡率，并伴有明显的临床体征，包括平衡丧失、异常游泳行为和呼吸窘迫。中间浓度（25 mg/L）死亡率增加至57.14%，但不良行为和生理表现持续存在。较低浓度（12.5 mg/L和6.25 mg/L）未导致死亡率或显著临床异常，斑马鱼在整个96小时暴露期间显示正常游泳行为、正确定向和稳定的呼吸功能。Karanjin的LC₅₀值为37.46 mg/L，表明其在较高浓度下具有急性毒性，同时在较低剂量下确认安全性。本研究确定10 mg/L和5 mg/L为低于LC₅₀阈值的安全浓度。

Karanjin recovers the bottom living and exploratory behaviour of zebrafish following Co-Supplementation with BPA

与对照组相比，BPA暴露组在新水箱潜水测试中表现出显著的行为异常，包括总移动距离减少、线路交叉次数减少以及接近上区延迟时间延长。最大游泳速度（p<0.0001）和在上区停留时间（p<0.01）也受到显著影响。这些结果表明BPA暴露导致焦虑样行为增加和探索行为减少。与BPA组相比，高剂量Karanjin补充有效逆转了这些缺陷，将线路交叉次数、最大游泳速度和总移动距离（p<0.0001）恢复到与对照组相当的水平。高剂量Karanjin在减少BPA诱导的行为缺陷方面表现出强效作用，显著增加在上区停留时间（p<0.01）并减少进入上区延迟时间（p<0.001）。低剂量Karanjin效果较差，但与BPA组相比仍显示适度改善（p<0.05）。标准治疗药物多奈哌齐和mentat也显著改善了BPA诱导的缺陷，在进入上区延迟时间（p<0.001）、在上区停留时间（p<0.01）、最大游泳速度（p<0.001）、线路交叉次数和总移动距离方面产生改善。这些常规治疗药物的效果与高剂量Karanjin相当。

Karanjin mitigates BPA-Induced cognitive impairments in the colour based appetite T-Maze test

T迷宫测试显示，与对照组相比，BPA暴露组存在显著的行为损伤，表现为在绿区停留时间减少、移动距离减少和进入绿区次数减少（p<0.0001）。这些变化表明认知功能、空间记忆、学习和探索行为严重受损。此外，BPA组显示更多进入红区次数和在红区停留时间，表明存在应激相关行为转变。与BPA组相比，高剂量Karanjin补充（10 mg/L）显著改善了行为结果，显著增加了在绿区停留时间（p<0.001）、移动距离（p<0.01）和进入次数（p<0.5），同时减少了红区指标（p<0.001）。这表明高剂量Karanjin有效减轻了BPA诱导的损伤，并将认知功能、空间记忆、学习和探索行为恢复到对照组观察到的水平。相比之下，低剂量Karanjin（5 mg/L）在这些参数上显示适度改善（p<0.05），但效果不如高剂量。标准治疗药物如多奈哌齐和mentat也产生了与BPA组相比的显著改善。这些药物增加了绿区活动（p<0.001）并减少了红区活动，显示出与高剂量Karanjin相当的反转BPA诱导行为缺陷的效果。

Karanjin ameliorates BPA-Induced cognitive deficits in the novel object recognition test in zebrafish

与对照组相比，BPA暴露组在新物体识别测试中显示显著的认知障碍。这些缺陷的特征是对新物体的偏好百分比显著下降，以及探索和互动时间减少。相比之下，BPA组在熟悉物体上花费更多探索时间，表明识别记忆和整体认知性能存在缺陷。高剂量Karanjin补充（10 mg/L）与BPA组相比显示识别记忆显著改善，表现为在熟悉物体上花费时间减少（p<0.05）和新物体偏好百分比显著增加（p<0.0001）以及在新物体上探索时间增加（p<0.0001）。这些发现突出了高剂量Karanjin在反转BPA诱导认知缺陷方面的功效。相反，低剂量Karanjin（5 mg/L）在这些参数上引起适度改善，但效果不如高剂量明显。类似地，标准治疗药物如多奈哌齐和mentat显著增强了与BPA组相比的识别记忆。这些药物增加了对新物体的偏好百分比（p<0.001）和在新物体上的探索时间（p<0.01），同时在熟悉物品上花费时间减少。这些物质具有与高剂量Karanjin相似的治疗效果。

Karanjin attenuates BPA-Induced memory impairments in zebrafish using the Y-Maze test

与对照组相比，BPA暴露组在Y迷宫测试中显示显著的认知和行为缺陷。BPA暴露导致转弯角度减小、总移动距离减少以及在Y迷宫偏好臂中停留时间百分比降低，表明空间记忆、探索活动和认知灵活性存在缺陷。高剂量Karanjin将转弯角度恢复（p<0.01）到接近对照组水平，并显著增加总移动距离（p<0.01），反映了运动活动和探索行为的增强。此外，高剂量Karanjin显著增加了在选定臂中停留时间百分比（p<0.001），表明空间记忆和认知性能改善。相反，低剂量Karanjin（5 mg/L）在这些参数上显示适度改善（p<0.05），但效果不如高剂量明显。标准治疗药物包括多奈哌齐和mentat也显著减轻了BPA诱导的缺陷。与BPA组相比，两种治疗都增加了在偏好臂中停留时间百分比（p<0.05）、转弯角度（p<0.01）和总移动距离（p<0.01和p<0.0001）。这些物质具有与高剂量Karanjin相当的恢复效果。

Impact of Karanjin on ache activity and oxidative stress in BPA-Treated zebrafish

与对照组相比，AChE活性评估显示BPA暴露组显著增加，表明BPA暴露引起胆碱能失调和神经毒性效应。类似地，BPA暴露诱导显著氧化应激，特征为总蛋白水平降低、超氧化物歧化酶(SOD)活性减少、脂质过氧化(LPO)水平增加（p<0.0001）以及谷胱甘肽(GSH)水平降低（p<0.0001），突出了BPA毒性相关的氧化损伤严重性和受损的抗氧化防御机制。高剂量Karanjin给药通过显著降低AChE活性（p<0.001）有效减轻了这些有害效应，并将其恢复到与对照组相当的水平，同时通过补充GSH水平（p<0.0001）、显著降低LPO水平（p<0.001）、增强SOD活性（p<0.01）和恢复总蛋白水平来对抗氧化应激，展示了其强大的神经保护和抗氧化能力。相反，低剂量Karanjin引起AChE活性适度降低（p<0.001），同时部分恢复氧化应激标志物，包括SOD活性、LPO水平降低（p<0.01）和GSH水平适度增加。然而，其效果不如高剂量Karanjin和标准治疗药物明显。标准药物如多奈哌齐和mentat对AChE活性和氧化应激标志物都表现出显著的改善效果，导致AChE活性显著降低（p<0.0001）、总蛋白水平恢复、SOD活性增强（p<0.05）（针对mentat）、LPO水平显著降低（p<0.0001）以及与BPA组相比GSH水平升高（p<0.0001）。值得注意的是，高剂量Karanjin的治疗潜力与标准药物相当，加强了其作为有效神经保护和抗氧化剂在减轻斑马鱼中BPA诱导的胆碱能失调和氧化损伤中的作用。

Mitigation of BPA-Induced neuronal degeneration in zebrafish brain by Karanjin

组织病理学评估显示对照组无异常，确认了在无毒条件下斑马鱼脑组织的结构完整性和正常组织架构。相比之下，BPA暴露组显示显著的神经退行性改变，包括神经元细胞变性、细胞质空泡化、血管充血和神经元周围间隙增加。这些变化主要出现在关键脑区如嗅球、视顶盖、端髓和延髓，严重程度各异。值得注意的是，在使用标准化解剖标志物评估的关键神经解剖区域脑室周围灰质区(PGZ)中一致观察到改变。低剂量Karanjin显示部分效果，导致神经元变性、空泡化和充血适度减少；然而这些改变的严重性仍然显著。相比之下，高剂量Karanjin治疗显著改善了这些组织病理学改变。神经元变性和空泡化显著减少，同时充血和神经元周围间隙异常也明显减少。类似地，标准治疗药物（多奈哌齐和mentat）有效减轻了BPA诱导的神经毒性，将组织病理学改变减少到最小或轻度严重性，并取得与高剂量Karanjin观察到的相当的结果。这些观察结果来自每组鱼4-5个解剖学可比切片（每组n=3），组织学特征使用基于goRENI/INHAND指南的标准化5点严重性量表进行半定量评分。评分以盲法进行以确保客观性和可重复性。

本研究强调了Karanjin通过恢复认知功能、保持神经元完整性以及调节氧化应激和胆碱能活性来减轻BPA诱导神经毒性的神经保护潜力。高剂量Karanjin（10 mg/L）有效逆转了行为损伤，降低了AChE活性，增强了抗氧化防御（GSH、SOD），并降低了脂质过氧化(LPO)，展示了与FDA批准的神经保护剂相当的功效。组织病理学分析证实了其在预防神经元萎缩、空泡化和血管充血方面的作用。这些发现将Karanjin定位为神经保护的有希望的候选物，特别是在阿尔茨海默病和其他神经退行性疾病中。然而，虽然当前研究侧重于行为、生化和组织学终点，但需要未来的研究来阐明潜在的机制通路，包括Nrf2/ARE信号和BDNF表达。此外，优化的配方策略和进一步的体内啮齿动物研究对于建立Karanjin在神经退行性疾病中的治疗潜力和转化应用性至关重要。