Frem2基因敲除小鼠模型揭示双侧肾缺如是Fraser综合征新生儿致死的关键原因

本研究针对Fraser综合征致病机制不清的问题，开发了首个FREM2基因完全敲除（KO）小鼠模型。研究人员发现Frem2-KO小鼠呈现典型的胚胎期血性水疱、隐眼畸形、并指畸形及新生儿双侧肾缺如，证实FREM2蛋白对皮肤、眼部及肾脏发育的关键作用。该模型为研究FREM2相关发育障碍提供了重要工具，对揭示Fraser综合征病理机制具有重要意义。

　　

在发育生物学和遗传学领域，Fraser综合征一直是一个令人困惑的难题。这种罕见的常染色体隐性遗传病以多种先天性畸形为特征，包括隐眼畸形（眼睑融合）、并指畸形（指/趾融合）以及肾缺如（肾脏发育不全）。更令人担忧的是，这些畸形从胚胎阶段就开始导致严重并发症，成为早期流产的重要原因之一。

科学家们早已发现，编码细胞外基质蛋白的基因突变与Fraser综合征密切相关。FRAS1、FREM1、FREM2及其相关运输蛋白GRIP1这些蛋白分子在胚胎发生过程中对维持上皮完整性至关重要。一旦这些蛋白出现缺陷，就会导致组织分离和小鼠模型中出现水疱表型。其中，FREM2蛋白是一个由3169个氨基酸组成的单次跨膜蛋白，但其在发育中的具体作用机制仍有许多未知。

尽管先前的研究已经报道了在患者中发现的错义变体编码的Frem2缺陷小鼠模型，或截短的FREM2蛋白产物，但直到最近，还没有在完全敲除（KO）小鼠模型中进行系统研究。这种研究空白限制了对FREM2功能的全面理解，也阻碍了对Fraser综合征机制的深入探索。

为了解决这一问题，由Artur A. Indzhykulian领导的研究团队在《Scientific Reports》上发表了他们的最新研究成果。他们开发并系统表征了 constitutive Frem2-KO 小鼠模型，这些小鼠表现出新生儿致死性，主要原因是双侧肾缺如，同时伴有血性水疱、隐眼畸形和并指畸形。令人惊讶的是，只有一只小鼠存活到成年期，表现出单侧肾缺如和Fraser综合征样表型。这些发现证实了FREM2在肾脏、皮肤和眼睛发育中的关键作用，并为研究FREM2相关发育障碍提供了宝贵的动物模型。

研究人员运用了多种关键技术方法开展本研究：通过欧洲条件性小鼠突变计划（EUCOMM）获取靶向Frem2基因的ES细胞克隆，采用FLP-FRT和Cre-loxP系统进行基因编辑以构建条件性敲除小鼠模型；通过胚胎时序交配和红外网络摄像头监测系统收集E13-E16胚胎和P0新生鼠样本；使用Bouin's固定液进行组织固定和石蜡包埋处理，制作5μm厚度的组织切片；采用苏木精- eosin（H&E）染色进行组织学分析，并通过Aperio AT2自动幻灯片扫描系统进行数字化成像；通过宏观解剖学和系列组织切片分析评估表型特征。

遗传分析显示Frem2-KO小鼠模型成功构建

研究人员从欧洲条件性小鼠突变计划购买了小鼠ES细胞克隆，用于生成携带具有条件潜能的knockout-first等位基因的Frem2tm1a(EUCOMM)Hmgu小鼠系（F2KCR等位基因）。首先，通过与FLP删除器品系交切除了FRT-flanked Neo盒，产生了条件性Frem2fl/fl等位基因。尽管生成的鼠标系设计为携带floxed Frem2等位基因以启用细胞类型特异性FREM2功能研究，但在与pan-Cre和组织特异性Cre系进行 several breeding steps后，研究人员无法生成成年纯合子Frem2-floxed小鼠。

通过对小鼠遗传学的进一步研究和floxed-Frem2小鼠插入位点的测序结果，研究人员在靶向插入位点内发现了突变，包括两个框内插入（27 bp和30 bp）和一个框内缺失（9 bp）。随后，他们分析了floxed Frem2等位基因外显子1中的开放阅读框，在外显子1中发现了一个提前终止密码子，这可能产生截短或缺失的FREM2蛋白，从而将floxed-Frem2等位基因有效地转化为组成性无效等位基因。

Frem2-KO小鼠爪部出现血性水疱和骨骼畸形

在研究胚胎（E13-16）时，研究人员立即观察到它们爪部的皮肤缺陷，这与先前报道FREM2在表皮发育中关键作用的研究一致。在E15和E16的Frem2-KO胚胎指部观察到血性水疱，这使得研究人员能够与表现正常的Frem2野生型和杂合子胚胎进行比较进行表型分析。

为了观察出生后肢体的发育情况，研究人员收集了新生Frem2幼崽。在评估新生Frem2-KO幼崽指部的血性水疱时，发现它们仍然存在但通常显得干燥。在新生Frem2-KO幼崽中，大多数后爪显示出软组织并指，与是否观察到水疱无关。受影响的爪部通常也表现出背屈，这是一种爪部向上弯曲的解剖学畸形。

研究人员接下来使用组织学切片评估了爪部的骨骼形成和其他形态特征，所有样本都以相同的方向制备。他们确定具有血性水疱、并指或背屈的新生Frem2-KO小鼠也在指部表现出骨骼畸形，周围的骨骼结构通常受损。有趣的是，这些骨骼畸形区域通常在后肢双侧发生。

FREM2缺陷导致Frem2-KO小鼠眼部异常

Frem2-KO胚胎早在E15就持续表现出明显的泡泡状血性水疱覆盖眼睛。E15 Frem2-KO胚胎头部的冠状组织学切片将水疱定位在眼睑附近或内部。在某些情况下，Frem2-KO胚胎的眼睑变薄和出血。这种出血和血性水疱在Frem2-KO胚胎的眼睑上双侧或单侧出现。

然而，在新生Frem2-KO幼崽中，没有观察到血性水疱。相反，Frem2-KO幼崽主要表现出眼睑缺失，眼睛周围的皮肤经常有出血。新生幼崽的头部进行冠状切片，使用苏木精和伊红染色评估眼睛形态。在野生型和杂合子Frem2幼崽中，眼睑的表皮层正常形成。而在Frem2-KO幼崽中，眼睑经常缺失或变薄。眼周出血和眼睑缺失在Frem2-KO幼崽中呈双侧或单侧发生。胚胎阶段眼睑上的血性水疱以及新生Frem2缺陷动物的眼睑缺失表明，适当的FREM2表达对眼睑的表皮发育至关重要。

Frem2-KO小鼠在出生后数小时内死亡

有趣的是，观察到母鼠产下表现出Frem2-KO胚胎表型的幼崽。然而，出生后几小时，这些幼崽被发现死在笼中。研究人员因此得出结论，Frem2-KO幼崽在出生后无法存活，并接下来调查这种死亡的原因。

对来自8窝的新生Frem2-KO幼崽进行了多个组织学切片和死后剖检。在几乎所有新生Frem2-KO幼崽中，研究人员观察到双侧肾缺如。可能是由于肾缺如缺乏尿液产生，Frem2-KO幼崽有空的膀胱。研究人员还常见到一侧或双侧肾上腺缺失。矢状旁切片进一步证实了新生Frem2-KO幼崽的肾缺如和空膀胱。

研究人员进行了系列横断组织学切片以增加宏观结果的置信度。所有Frem2-KO幼崽，除一只外，都有双侧肾缺如，通过剖检或组织学评估确认。一只新生Frem2-KO幼崽显示有一个小但发育的肾脏，确认了单侧肾缺如。该肾脏的功能能力和该动物的生存机会尚不清楚，尽管在先前年份中曾观察到一只存活的Frem2-KO幼崽。所有检查的Frem2-KO幼崽也有空膀胱。通过剖检或组织学分析检查，在Frem2-KO幼崽中没有发现其他重要器官（如肺和心脏）的主要缺陷。将肺浸入磷酸盐缓冲盐水中评估是否充满空气，确认它们能漂浮，表明动物在死亡前正在呼吸。研究人员得出结论，Frem2-KO幼崽出生后死亡的可能原因是肾缺如。

单个Frem2-KO小鼠存活至成年期

经过多年的繁殖，在这项研究中只发现一只雌性Frem2-KO小鼠并存活到成年。虽然没有发现明显的健康状况，并且该动物生产了两窝，但这只雌性在51周龄时因溃疡性皮炎（老年小鼠常见病症）被安乐死。

有趣的是，这只小鼠表现出身体表型，如单侧隐眼畸形。小鼠的左眼闭合，没有可见的眼睑皱褶。然而，对侧眼睛看起来正常。通过对闭合眼睑皮肤进行死后切口，发现了一个显著较小的眼球，将其与对侧眼睛一起送去做组织学分析。组织学分析显示右眼正常发育，左眼畸形。左眼明显较小，视网膜出现褶皱，这是小眼症中常见的特征。

与新生Frem2-KO小鼠中的观察一致，成年小鼠的前爪看起来正常，而双后爪都受到并指的影响。后爪也轻微弯曲，与新生儿中观察到的爪部相似。研究人员接下来检查了这只成年小鼠的肾脏系统，发现它有一个功能肾脏。右侧没有肾脏组织的宏观证据。左肾完全附着于输尿管以及泌尿系统的其余部分。左肾的苏木精-伊红染色组织学切片确认了肾上腺和肾脏的正常形态。组织学切片的高倍图像显示正常的肾上腺和肾脏形态，保留了肾小管和肾单位。组织学评估还显示右侧输尿管缺失。虽然缺少一个肾脏，但这只Frem2-KO雌性的生殖功能没有受到影响，使其能够繁殖和生产幼崽。根据宏观检查，肾盂也扩张了。由于有一个功能肾脏，膀胱是满的。尽管这只雌性凭借一个功能肾脏存活，但Frem2-KO成年小鼠表现出其他显著的Fraser综合征表型，如隐眼畸形和并指畸形。

研究结论与重要意义

这项研究开发了组成性敲除（KO）Frem2小鼠模型来评估相关表型。研究结果揭示，FREM2蛋白的缺失导致显著的Fraser综合征样表型，包括隐眼畸形、并指畸形和血性水疱，这些在胚胎阶段就可以观察到。Frem2-KO幼崽表现出明显的表型，甚至在基因分型进行前就能在窝中识别出来。虽然Frem2-KO小鼠可以存活到出生，但它们随后很快死亡，很可能由于双侧肾缺如。到目前为止，只有一只来自动物群体的单侧肾缺如Frem2-KO小鼠存活到成年。这些结果突显了FREM2在表皮、眼睛、骨骼结构和肾脏发育中的关键作用。

细胞外基质（ECM）以其提供结构支持的作用而闻名。然而，它还在通过调节细胞增殖、分化和存活来维持组织完整性方面发挥关键作用。FRAS1、FREM1和FREM2作为ECM蛋白复合物的重要组成成分，是结构相似的蛋白。先前的研究表明，这些蛋白中任何一种的缺失都会导致严重表型，表明它们在任何主要方面都不能相互替代。正如先前在Frem2突变小鼠中报道的，不仅是FREM2，而且FRAS1和QBRICK/FREM1都从基底膜区耗尽，表明一个复合物成员的缺失会导致其他成员的耗尽，显示了相互依赖性。

ECM包括在上皮和内皮细胞层下方形成片的基底膜。FREM2定位在上皮基底膜内。先前使用免疫金标记的研究证明了FREM2在胚胎皮肤致密层下的簇状定位，突显了其在组织完整性中的重要性。缺乏ECM蛋白（如FREM2）的小鼠模型揭示了ECM组分破坏如何导致水疱表型，突出了遗传突变与必需基底膜组装之间的复杂关系。

研究人员观察到的新生Frem2-KO小鼠的骨骼畸形、并指和背屈不太可能源于骨发育的主要缺陷，因为Frem2尚未被直接 implicated 在骨生成中。这进一步支持了结论，即FREM2不仅对血管稳定性至关重要，而且对妊娠期间的组织重塑和骨骼发育也至关重要。支持这一解释的是，涉及缺乏普遍基底膜蛋白（如巢蛋白1和巢蛋白2）的小鼠模型的研究表明，仅外胚层基底膜的破坏就足以导致肢体畸形。这强化了基底膜完整性对正常肢体发育至关重要的观点。

这项研究开发的 constitutive Frem2-KO 小鼠模型为Fraser综合征研究提供了重要工具。虽然先前的研究使用了各种Frem2小鼠模型，其中一些保留了有限的FREM2功能，但这里报道的小鼠模型预计完全缺乏FREM2。研究结果揭示，Frem2-KO幼崽在出生后很快死亡，限制了深入研究的机会。然而，研究人员已经确定了最突出的表型和新生儿死亡的主要原因。这项研究提供了一个独特而严重的Fraser综合征模型，可用于未来的胚胎研究，以推进对Fraser综合征病理生理学的理解。