新型含二硫键小分子PD-1/PD-L1抑制剂的发现及其在流感治疗中的突破性应用

为解决抗体类免疫检查点抑制剂引发的细胞因子风暴等问题，研究人员开展新型含二硫键小分子PD-1/PD-L1抑制剂研究，发现化合物2（DTBBA）可选择性结合PD-L1（KD=77.60±4.44 nM），通过独特结合模式阻断PD-1/PD-L1互作，在流感病毒感染小鼠模型中显著提升中和抗体滴度并缓解肺炎症状，为病毒早期感染治疗提供新策略。

　　

在免疫治疗领域，靶向程序性死亡蛋白1（PD-1）及其配体（PD-L1）的 monoclonal antibody（单克隆抗体）药物已在癌症治疗中取得突破性进展。然而，这类抗体药物存在不可忽视的局限性：它们可能引发免疫相关不良反应，如炎症和肺炎，这往往源于细胞因子风暴的过度激活；此外，抗体药物生产成本高昂，不能口服给药，半衰期较短，且在器官和肿瘤中的渗透性较差。因此，开发低分子量的免疫检查点小分子抑制剂成为当前研究的热点，尤其是在病毒性疾病治疗中的应用潜力亟待探索。

病毒感染的早期阶段，免疫检查点分子的上调可能导致T细胞功能耗竭，削弱机体清除病原体的能力。流感病毒（Influenza virus, IFV）感染就是一个典型例子，它可能引发严重的肺炎甚至死亡。虽然已有研究尝试将免疫检查点抑制剂用于病毒性疾病治疗，但抗体药物的安全性和适用性限制使其难以广泛应用。能否找到一种小分子化合物，既能有效阻断PD-1/PD-L1通路，又具备良好的口服生物利用度和安全性，成为研究人员关注的焦点。

在这项发表于《Scientific Reports》的研究中，日本大阪医疗药学大学和大阪大学的Yoshiyuki Hirata、Kyoko Hayashi、Takuma Kato、Yasuo Nagaoka、Mitsunobu Doi和Shinichi Uesato团队从含硫蛋白-蛋白相互作用（PPI）抑制剂化合物库中筛选出一种新型含二硫键的小分子PD-1/PD-L1抑制剂——化合物2（2-benzamido diphenyl disulfide，DTBBA）。该化合物不仅表现出与阳性对照BMS-1相当的抑制活性，还通过独特的结合机制选择性靶向PD-L1，并在流感病毒感染的小鼠模型中展现出显著的治疗效果。

研究团队主要采用了以下关键技术方法：通过酶联免疫吸附测定（ELISA）进行初步化合物筛选；利用表面等离子共振（SPR）技术分析化合物与PD-L1的结合亲和力和特异性；采用分子对接模拟（使用Molecular Operating Environment软件）研究化合物与PD-L1二聚体的结合模式；通过T细胞活化恢复实验（使用Jurkat(E6-1)和MDA-MB-231细胞共培养系统）评估化合物的免疫调节功能；最后在BALB/c小鼠流感病毒感染模型（病毒株为A/NWS/33, H1N1亚型）中进行体内药效评价。

Identification of new type of PD-1/PD-L1 inhibitor 2 by ELISA analysis

通过ELISA分析，研究人员从一系列含硫化合物中筛选出化合物2（DTBBA），它在10μM浓度下对PD-1/PD-L1结合的抑制率达到76%，与阳性对照BMS-1（58%）相比表现出更强的抑制活性。结构-活性关系研究表明，二硫键结构和对位取代的苯甲酰胺基团对抑制活性至关重要，而将二硫键替换为-CH₂-O-等生物电子等排体（化合物16）则导致活性完全丧失。

Determination of the binding preference of compound 2 to PD-L1 over PD-1 by surface plasmon resonance(SPR)

SPR分析证实化合物2选择性结合PD-L1而非PD-1，其平衡解离常数（K_D）为77.60±4.44 nM。当化合物2（0.01μM）与PD-1 Fc Chimera（0.1μM）预混合后，最大结合响应（R_max）降至对照值的71%，与BMS-1（56%）效果相当，表明化合物2通过直接结合PD-L1阻断PD-1/PD-L1相互作用。

T-cell activation recovery assay

在T细胞活化恢复实验中，化合物2（10μM）显著提升γ-干扰素（IFN-γ）和白细胞介素2（IL-2）的产生水平，分别增加54.9%和130%，效果与阳性对照CA-170相当。值得注意的是，化合物2单独处理MDA-MB-231细胞或预活化的Jurkat(E6-1)细胞时对细胞因子分泌影响有限，但在共培养体系中显著促进细胞因子产生，表明其T细胞活化功能依赖于PD-1/PD-L1相互作用的阻断。

Docking simulation of BMS-202 and compound 2 into the PD-L1 dimer

分子对接模拟揭示了化合物2与PD-L1二聚体的独特结合模式：其二硫键中的一个硫原子与Met¹¹⁵的硫原子形成非共价硫-二硫相互作用，羰基基团与Tyr¹²³的NH形成氢键，芳香环D与Asn⁶³产生π-烷基相互作用。这种结合机制与BMS-202通过静电相互作用稳定结合的模式截然不同，解释了二硫键对化合物2活性的关键作用。

Oral administration of compound 2,7, and oseltamivir to mice with IFV(A/NWS/33, H1N1 subtype)

动物实验表明，口服化合物2（1 mg/只/天）显著缓解流感病毒感染小鼠的体重下降（图5A），第3天肺组织病毒滴度降低至对照的45%（p<0.01）（图5B）。更引人注目的是，化合物2处理组在第14天支气管肺泡灌洗液（BALFs）和血清中的中和抗体滴度分别提升2.4倍和1.7倍（p<0.05），而阳性对照奥司他韦则显著抑制抗体产生。化合物2的单体前药7也表现出类似但稍弱的效果。

In vitro anti-influenza virus activity of compound 2

为排除化合物2的直接抗病毒作用，研究人员评估了其体外抗流感病毒活性。结果表明化合物2对MDCK细胞的半数细胞毒性浓度（CC₅₀）为20±2.1μg/mL，而对流感病毒的半数有效浓度（EC₅₀）为110±9.2μg/mL，选择指数（SI=CC₅₀/EC₅₀）仅为0.18±0.035，远低于具有直接抗病毒活性的化合物标准（SI>10），证实其体内效果确实通过免疫调节机制而非直接病毒抑制实现。

研究结论与讨论部分强调，化合物2作为一种新型含二硫键小分子PD-1/PD-L1抑制剂，通过独特的结合机制选择性靶向PD-L1，有效阻断PD-1/PD-L1相互作用并恢复T细胞功能。在流感病毒感染模型中，口服化合物2不仅降低病毒滴度，还显著提升中和抗体水平，这种"既减病毒又增抗体"的双重效果为病毒早期感染治疗提供了新思路。

值得注意的是，化合物2（DTBBA）作为一种橡胶塑解剂已广泛应用于轮胎等橡胶制品生产过程中，环境中的橡胶磨损颗粒可能含有该化合物。本研究首次揭示其免疫调节功能，为评估其生态环境和健康影响提供了重要科学依据。

该研究的重要意义在于：首先，发现了一种具有全新结合机制的小分子PD-L1抑制剂，为克服抗体药物的局限性提供了替代方案；其次，证实免疫检查点小分子抑制剂在病毒性疾病治疗中的应用潜力，特别是对流感等呼吸道病毒感染的治疗效果；最后，研究结果提示现有工业化学品中可能隐藏着具有潜在生物活性的分子，为药物重定位研究提供了新方向。

未来研究可进一步优化化合物2的结构以提高其选择性和安全性，并探索其在其他病毒性疾病（如COVID-19）中的应用价值。同时，需要深入探讨化合物2对HDAC6的双重抑制效应（补充数据所示）在其免疫调节作用中的贡献，这可能为开发多靶点免疫治疗药物提供新策略。