ALPK1信号通路通过TIFA/TRAF6/NF-κB介导细胞焦亡在糖尿病视网膜病变中的作用机制研究

本研究针对糖尿病视网膜病变(DR)中慢性炎症导致视网膜损伤的核心问题，开展了ALPK1信号通路在DR发病机制中作用的深入探索。研究人员通过db/db糖尿病小鼠模型和BV2小胶质细胞缺氧模型，发现ALPK1通过激活TIFA/TRAF6/NF-κB信号轴，进而触发NLRP3/Caspase-1/GSDMD细胞焦亡通路，导致炎症因子大量释放。研究证实ALPK1基因敲除可显著减轻视网膜炎症反应和微血管损伤，为DR治疗提供了新的潜在靶点。该成果对理解DR发病机制和开发新型治疗策略具有重要意义。

　　

糖尿病视网膜病变(diabetic retinopathy, DR)作为糖尿病最常见且严重的微血管并发症，已成为工作年龄人群视力丧失的首要原因。随着糖尿病发病率的不断攀升，DR带来的视觉损害和社会经济负担日益加重。目前临床治疗主要依赖抗VEGF药物和激光光凝等干预手段，但存在疗效有限、需要反复眼内注射、伴随副作用等诸多局限性。因此，深入探索DR的发病机制并寻找新的治疗靶点显得尤为迫切。

长期以来，慢性炎症被视为DR发生发展的核心病理机制。在糖尿病视网膜中，持续高糖状态导致损伤相关分子模式(DAMP)释放，激活模式识别受体(PRR)，引发天然免疫反应失衡，进而驱动视网膜微血管损伤和神经元变性。然而，这一过程中的关键分子机制尚未完全阐明。Alpha激酶1(ALPK1)作为新发现的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶家族成员，在心脏和肾脏疾病等多种炎症性疾病中发挥重要调控作用。值得注意的是，ALPK1基因的功能获得性突变可引起一种罕见的遗传性疾病——ROSAH综合征，该疾病以眼内炎症反应为特征性表现之一。这些线索提示ALPK1可能在DR的炎症进程中扮演着重要角色，但其具体作用和分子机制仍有待揭示。

发表在《Scientific Reports》的这项研究旨在系统探讨ALPK1在DR中的功能及其作用机制。研究人员综合运用了体内外实验模型：体内采用db/db自发性糖尿病小鼠（12-24周龄）作为DR模型，体外使用BV2小胶质细胞系建立缺氧模型模拟DR条件。关键技术方法包括：视网膜组织学分析（HE染色、视网膜铺片PAS染色）、荧光素眼底血管造影(FFA)、免疫荧光染色、蛋白质免疫印迹(Western blot)、实时定量PCR(qRT-PCR)、酶联免疫吸附测定(ELISA)、细胞活力检测(CCK-8)和乳酸脱氢酶(LDH)释放测定等。通过玻璃体腔内注射慢病毒载体实现ALPK1基因敲除，评估其对视网膜病变的影响。

视网膜病变在12-24周龄db/db小鼠中发展

研究结果显示，与db/m正常对照组相比，db/db小鼠从12周龄开始体重和血糖水平显著升高，在20-24周龄达到峰值。眼底成像和荧光素血管造影显示db/db小鼠出现视网膜色素上皮变性、渗出液、微动脉瘤和视网膜内血管改变等典型DR表现。HE染色表明db/db小鼠视网膜神经节细胞层(GCL)细胞数量减少，视网膜神经纤维层(RNFL)、GCL、内丛状层(IPL)和内核层(INL)厚度变薄。视网膜胰酶消化铺片显示db/db小鼠无细胞毛细血管数量显著增加，表明毛细血管退化加剧。

ALPK1通路和GSDMD焦亡通路在db/db小鼠视网膜中被诱导

研究发现db/db小鼠视网膜中ALPK1 mRNA和蛋白表达水平显著上调。Western blot分析显示TIFA磷酸化和TRAF6激活水平增加。免疫荧光染色证实NF-κB p65发生核转位，NLRP3蛋白水平升高。下游介质caspase-1和GSDMD的表达也显著增加，表明ALPK1通过调节NF-κB和NLRP3炎症小体激活参与DR进展。

db/db小鼠视网膜中观察到视网膜小胶质细胞激活和炎症

免疫荧光分析显示db/db小鼠视网膜中IBA-1阳性细胞数量增加，表明小胶质细胞激活。RT-qPCR和ELISA检测显示视网膜组织和血浆中TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-18水平显著升高，表明糖尿病视网膜内存在炎症环境。

缺氧后BV2细胞中ALPK1被诱导

研究发现高糖条件并不能显著诱导BV2细胞中ALPK1表达，而缺氧处理(1% O₂，24小时)能够有效激活小胶质细胞并显著增加ALPK1蛋白水平。缺氧处理24小时后，小胶质细胞完全激活，表现为细胞体增大和阿米巴样形态，细胞活力下降。

ALPK1敲低抑制缺氧诱导的BV2细胞中ALPK1通路和GSDMD焦亡通路

通过构建ALPK1稳定敲低细胞系(sgALPK1)，研究发现ALPK1敲低可抑制缺氧诱导的TIFA磷酸化、TRAF6激活和NF-κB p65核转位。同时，ALPK1敲低还降低了NLRP3、c-caspase-1/caspase-1、GSDMD-N/GSDMD水平，表明ALPK1 knockdown可减轻缺氧诱导的炎症反应。

ALPK1敲低抑制缺氧诱导的BV2细胞炎症

研究显示，ALPK1敲低可提高缺氧条件下BV2细胞活力，并降低细胞上清液中IL-1β、IL-6、IL-18和TNF-α水平，表明ALPK1抑制可减轻缺氧诱导的炎症反应。

ALPK1敲低抑制缺氧诱导的BV2细胞上清液引起的RGC-5细胞和RMECs损伤

将RGC-5细胞和视网膜微血管内皮细胞(RMECs)与BV2细胞条件培养基共培养后发现，来自缺氧BV2细胞的条件培养基可降低RGC-5细胞和RMECs的活力，增加LDH释放。而来自ALPK1敲低BV2细胞的条件培养基可增加RGC-5细胞和RMECs的存活率，减少LDH释放，表明ALPK1敲低可减轻对视网膜和微血管细胞的损伤。

ALPK1敲低减轻糖尿病小鼠视网膜损伤

通过在16周龄db/db小鼠玻璃体腔内注射携带ALPK1低表达的慢病毒(sgALPK1)，研究发现ALPK1敲低可减少视网膜渗出液，增加GCL和全视网膜层细胞数量，减少无细胞毛细血管数量，表明ALPK1敲低可减轻糖尿病诱导的视网膜损伤。

本研究系统阐明了ALPK1在糖尿病视网膜病变中的关键作用及其分子机制。研究发现ALPK1在DR状态下表达上调，通过激活TIFA/TRAF6/NF-κB信号通路，进而触发NLRP3/caspase-1/GSDMD细胞焦亡通路，导致大量炎症因子释放，最终引起视网膜微血管损伤和神经元丢失。ALPK1基因敲除可显著减轻视网膜炎症反应、细胞焦亡和微血管损伤。

这些发现不仅深化了对DR发病机制的理解，而且为DR治疗提供了新的潜在靶点。靶向ALPK1信号通路可能成为治疗DR的新策略，特别是针对那些对抗VEGF治疗反应不佳的患者。此外，本研究建立的ALPK1敲低动物模型为后续药物开发和临床前研究提供了重要工具。

研究的局限性在于视网膜组织包含多种细胞类型，如小胶质细胞、视网膜微血管内皮细胞、视网膜色素上皮细胞和视网膜神经节细胞等，ALPK1通过这些细胞在DR发生发展中的具体生理机制尚未完全阐明，这为未来研究指明了方向。抑制细胞焦亡和阻断炎症小体介导的细胞死亡通路可能代表未来DR治疗的新策略。

总的来说，这项研究揭示了ALPK1在糖尿病视网膜病变中的核心作用，提供了坚实的实验证据支持ALPK1作为治疗靶点的潜力，为开发新型DR治疗方法奠定了理论基础。