转移性结直肠癌(mCRC)免疫微环境探索：基于生物信息学分析发现9个关键诊断生物标志物及浸润免疫细胞特征

本研究针对转移性结直肠癌(mCRC)诊断标志物匮乏、免疫微环境机制不明的问题，通过整合TCGA和GEO数据库转录组数据，结合ssGSEA、xCell算法和PPI网络分析，首次发现AGTR1/CD86/CMKLR1等9个免疫相关枢纽基因与上皮细胞显著负相关，揭示了mCRC中内皮细胞/中性粒细胞浸润上升而红细胞/肌细胞下降的免疫景观，为mCRC免疫诊断和靶向治疗提供了新视角。

　　

结直肠癌(CRC)作为全球第三大常见恶性肿瘤和第二大癌症死亡原因，其转移性阶段(mCRC)的治疗抵抗性和生存率骤降尤为突出。尽管手术和化疗技术不断进步，但mCRC的5年生存率仍显著低于早期CRC，这主要是由于肿瘤微环境(TME)中复杂的免疫逃逸机制和缺乏有效的早期诊断标志物。当前临床诊断方法在敏感性和特异性方面存在明显不足，而高通量测序技术的发展为解析mCRC的分子机制提供了新的机遇。

研究人员通过整合癌症基因组图谱(TCGA)和基因表达综合库(GEO)数据库中的转录组数据，结合单样本基因集富集分析(ssGSEA)、xCell算法和蛋白质互作网络(PPI)分析，首次系统描绘了mCRC特有的免疫细胞浸润图谱，并筛选出具有诊断价值的生物标志物。研究团队从TCGA-CRC队列的567个样本和GSE33113等三个GEO数据集中筛选出28个免疫相关差异表达基因(ICDEGs)，并进一步通过CytoHubba插件中的8种拓扑算法鉴定出9个枢纽基因(AGTR1, CD86, CMKLR1, FGF1, FYN, IL10RA, INHBA, TNFSF13B, VEGFC)。

关键技术方法包括：从TCGA和GEO数据库获取567例CRC样本转录组数据；使用edgeR和limma包筛选差异表达基因；采用ssGSEA和xCell算法分析64种免疫/基质细胞浸润水平；通过DAVID进行GO/KEGG富集分析；利用STRING数据库和Cytoscape构建PPI网络；应用ROC曲线和Kaplan-Meier生存分析验证诊断及预后价值。

免疫细胞浸润分析揭示mCRC特异性免疫微环境特征

通过ssGSEA算法对28种免疫细胞群体的分析显示，mCRC组织中抗原呈递细胞共抑制(APC co-inhibition)、CD8⁺ T细胞、检查点分子和炎症促进因子等免疫细胞亚群存在显著差异。更精细的xCell算法分析64种细胞类型发现，mCRC中内皮细胞(p=2.7e-08)、中性粒细胞(p=1.2e-07)和淋巴管内皮细胞(p=3.5e-09)显著富集，而上皮细胞(p=2.4e-12)、红细胞(p=1.5e-07)、巨核细胞-红细胞祖细胞(MEP)(p=3.8e-09)和骨骼肌细胞(p=1.1e-09)明显减少。相关性分析显示淋巴管内皮细胞与内皮细胞呈强正相关(r=0.74)，与MEP呈负相关(r=-0.39)。

ICDEGs功能富集分析提示免疫调控主导作用

对28个免疫相关差异表达基因的功能分析显示，这些基因主要富集于细胞过程、刺激反应、生物调节等生物过程(BP)，细胞外周、血浆膜等细胞成分(CC)，以及信号受体结合、分子功能调控等分子功能(MF)。KEGG通路分析显著富集于细胞因子-细胞因子受体相互作用、癌症通路、人类巨细胞病毒感染等途径，表明ICDEGs通过免疫调控网络影响mCRC进展。

枢纽基因筛选与验证确立诊断标志物

通过PPI网络构建和CytoHubba插件的8种拓扑算法(MCC、Degree、EPC等)筛选出12个枢纽基因，最终验证9个在独立数据集(GSE26906和GSE41568)中持续高表达的基因：AGTR1、CD86、CMKLR1、FGF1、FYN、IL10RA、INHBA、TNFSF13B和VEGFC。ROC曲线分析显示这些基因对mCRC具有优异诊断效能(AUC: 0.703-0.842)，其中AGTR1、CD86、CMKLR1和TNFSF13B在mCRC研究中较少报道。

枢纽基因与线粒体功能及预后的关联分析

研究发现179个差异表达的线粒体功能相关基因(DE-MFRGs)与多数枢纽基因存在显著相关性(|r|≥0.5, p<0.05)，提示免疫调控与代谢重编程在mCRC中的交叉对话。生存分析显示FGF1(p=0.037, HR=1.6)和VEGFC(p=0.027, HR=1.6)高表达与不良预后显著相关，AGTR1虽未达统计学显著性(p=0.072)但呈现高风险趋势(HR=1.5)。

生物标志物与免疫细胞浸润的调控网络

相关性分析发现上皮细胞与TNFSF13B(r=-0.81)、CD86(r=-0.77)和IL10RA(r=-0.70)呈显著负相关，揭示了这些基因可能通过上皮-间质转化(EMT)或上皮-免疫交互作用参与TME重塑。各枢纽基因通过不同机制驱动mCRC进展：VEGFC/FGF1促进血管/淋巴管生成；INHBA/FYN/AGTR1介导EMT和侵袭；CD86/IL10RA/TNFSF13B/CMKLR1调控免疫抑制微环境。

研究结论表明，mCRC的进展由促转移信号（血管生成、EMT、侵袭）和免疫抑制信号（T细胞抑制、髓系细胞调控）协同驱动，共同塑造了富含内皮/淋巴/中性粒细胞而缺乏上皮/红细胞/MEP的免疫微环境。发现的9个枢纽基因不仅为mCRC提供了可靠的诊断标志物，其与特定免疫细胞群的显著相关性更为理解mCRC的免疫逃逸机制提供了新视角。尽管回顾性数据分析和机制探索深度存在局限，但本研究首次应用xCell算法解析mCRC免疫景观，建立了免疫相关基因与细胞浸润的关联网络，为开发mCRC的免疫治疗策略奠定了理论基础。