黑豆(Vigna mungo)不同发育阶段和胁迫条件下qRT-PCR最佳内参基因的鉴定与验证

本研究针对黑豆(Vigna mungo)qRT-PCR数据标准化缺乏稳定内参基因的问题，系统评估了14个候选基因在17个发育阶段和4种非生物胁迫下的表达稳定性。通过geNorm、NormFinder、BestKeeper和ΔCt方法综合分析，发现RPS34和RHA最适合发育阶段标准化，而ACT2和RPS34在胁迫条件下表现最佳。该研究为豆科植物基因表达分析提供了可靠标准，显著提升qRT-PCR结果的准确性和可重复性。

　　

随着测序技术的飞速发展，豆科作物的基因组学资源日益丰富，曾经被称为"孤儿作物"的豆类如今迎来了研究的春天。鹰嘴豆、木豆、黑豆和瓜尔豆等多种豆科作物的基因组序列相继公布，为功能基因组学研究奠定了坚实基础。然而，在这些基因组资源的背后，隐藏着一个关键的技术挑战——如何准确可靠地进行基因表达分析？

基因表达谱分析已成为现代分子生物学和分子育种研究不可或缺的技术手段。其中，定量逆转录聚合酶链反应(qRT-PCR)因其高灵敏度和准确性，成为基因表达研究的金标准。但qRT-PCR结果容易受到RNA质量、加样误差等实验技术因素的影响，这就需要通过内参基因(Housekeeping Genes, HKGs)进行标准化来消除这些技术误差。理想的内参基因应该在各种实验条件下保持稳定表达，但事实上，没有任何一个基因能在所有组织和条件下都保持恒定表达。

黑豆(Vigna mungo)，又称黑吉豆或乌拉豆，是印度次大陆仅次于鹰嘴豆和木豆的第三重要食用豆类。这种营养丰富的豆科作物含有丰富的蛋白质、纤维以及铁、锌、钾等必需微量元素。其适应性强、生育期短且具有固氮能力，深受小农户和边缘农户的青睐。随着全球面临气候变化、人口增长和营养安全等紧迫问题，黑豆作为营养丰富的农业重要作物正受到越来越多的关注。

尽管黑豆如此重要，但在分子生物学研究方面却长期被忽视，缺乏可靠的qRT-PCR内参基因成为制约其基因功能研究的瓶颈。为了解决这一问题，印度 pulses研究所的研究团队开展了一项系统性的研究，旨在鉴定黑豆中最稳定的内参基因，为后续的基因表达研究提供可靠标准。

研究人员采用了多种技术方法的组合策略来确保研究的全面性和可靠性。他们选取了17个不同发育阶段的组织样本（从萌发期的胚芽、胚根和子叶到成熟期的荚果和种子）以及4种非生物胁迫处理（干旱、盐、铝和冷胁迫）下的幼苗组织，使用qRT-PCR技术分析了14个候选内参基因的表达情况。通过RefFinder平台整合geNorm、NormFinder、BestKeeper和ΔCt四种算法进行综合评估，最后选择5个测试基因（CAM、PR1、HSP70、NAC和DEF）对优选内参基因进行验证。

基因表达稳定性在不同发育阶段的分析

研究团队通过qRT-PCR技术分析了14个候选基因在17个组织中的表达情况，发现这些基因的Ct值存在显著差异，范围从10.84(RBCS3B)到39.82(ISTL6和CyP)。利用geNorm算法分析显示，RPS34和RHA基因最为稳定，平均稳定性值为1.238，而UFO基因最不稳定。ΔCt方法分析也得出了类似结论，RPS34和RHA仍然是最稳定的基因。BestKeeper算法则识别USB1为最稳定基因，而NormFinder算法认为RPS34和ACT2最为稳定。综合RefFinder的全面排名，RPS34和RHA被确定为在不同发育阶段中最适合qRT-PCR数据标准化的内参基因。

基因表达稳定性在不同非生物胁迫下的分析

在四种非生物胁迫条件下，基因表达稳定性分析显示了不同的模式。geNorm算法识别RPS34为最稳定基因，USB1次之；ΔCt方法发现ACT2和RPS34最为稳定；BestKeeper算法则认为USB1和DNAJ最稳定；而NormFinder算法识别ACT2和DNAJ为最稳定基因。综合RefFinder的全面评估，ACT2和RPS34被确定为在非生物胁迫条件下最稳定的内参基因。

候选内参基因的验证

为了验证优选内参基因的可靠性，研究人员使用RPS34、RHA和ACT2基因以及之前报道的Actin(ACT)基因作为内对照，对5个测试基因（CAM、PR1、HSP70、NAC和DEF）进行表达分析。结果显示，使用ACT作为内对照时，测试基因的相对表达倍数存在较大偏差，而使用本研究鉴定的内参基因进行标准化后，表达结果更加稳定和一致，证明了RPS34、RHA和ACT2基因在qRT-PCR实验中的优越性和适用性。

本研究通过全面系统的分析，确定了黑豆中最适合qRT-PCR数据标准化的内参基因组合：针对发育阶段组织，推荐使用RPS34和RHA组合；针对胁迫处理组织，推荐使用ACT2和RPS34组合。这一发现解决了黑豆基因表达研究中长期缺乏可靠内参基因的问题。

核糖体蛋白RPS34的稳定性可能源于其在蛋白质生物合成机制中的核心作用，虽然核糖体蛋白在所有生物领域都被报道为重要的内参基因，但在qRT-PCR标准化研究中却很少被探索。RNA解旋酶(RHA)作为RNA代谢中的关键酶，参与RNA二级结构的解旋和RNA结合蛋白的置换，对细胞生长和发育至关重要，这解释了其在各种组织中稳定表达的原因。

值得注意的是，尽管不同算法在基因排名上存在细微差异，但研究结果明确表明RPS34和RHA在发育阶段最为稳定。在胁迫条件下，ACT2的表现优于RPS34，这可能是因为细胞骨架相关基因如actin在胁迫条件下仍能保持稳定表达，以维持细胞形态和机械完整性。

与之前Kundu等人仅使用7个内参基因并在两种胁迫条件下进行的研究相比，本研究不仅使用了更多的候选基因，而且涵盖了更广泛的发育阶段（17个组织）和胁迫条件（盐、干旱、铝和冷胁迫）。本研究鉴定的RPS34、RHA和ACT2基因具有巨大的应用潜力，可在任何基因表达实验中作为内参基因使用。

作为目前关于豇豆属物种内参基因鉴定最全面的报告，本研究发现的内参基因很可能也适用于其他豇豆属物种，如绿豆(Vigna radiata)、豇豆(Vigna unguiculata)和赤豆(Vigna angularis)，这些物种与黑豆有着较近的亲缘关系。

该研究的发现为豆科植物特别是豇豆属物种的基因表达研究提供了重要标准和工具，将显著提高qRT-PCR结果的可靠性和一致性，推动这些重要作物的功能基因组学和分子育种研究进展。研究成果发表在《Scientific Reports》期刊上，为植物分子生物学研究提供了有价值的技术资源。