利用大卵泡来源的细胞外囊泡提升玻璃化冷冻牛卵母细胞的发育潜能

《Scientific Reports》：Enhancing developmental potential of vitrified in vitro matured bovine oocytes using extracellular vesicles from large follicles

本研究针对卵母细胞玻璃化冷冻后存活率与胚胎发育能力下降的难题，创新性地探讨了不同大小卵泡（3–5 mm小卵泡与>9 mm大卵泡）来源的卵泡液细胞外囊泡（FF-EVs）对牛卵母细胞冷冻耐受性的影响。通过体外成熟阶段添加FF-EVs，发现大卵泡来源的EVs能显著改善冷冻后卵母细胞的纺锤体形态、降低DNA碎片率，并提升囊胚形成率与质量。该研究为优化卵母细胞冷冻保存技术提供了新策略，对生殖医学与家畜育种具有重要应用价值。

　　

在生殖生物学与辅助生殖技术领域，卵母细胞的长期保存是推动物种保护、家畜育种及人类生殖医学发展的核心环节。玻璃化冷冻作为当前主流的冷冻保存技术，虽能快速固化细胞以避免冰晶损伤，却仍无法避免冷冻应激引发的多重损害：包括细胞内钙离子过早释放、染色体异常、微管结构破坏、氧化应激导致的线粒体与内质网功能障碍等。这些损伤直接导致冷冻后卵母细胞存活率低、胚胎发育潜能下降，使其无法与新鲜卵母细胞相媲美。尽管研究者已尝试优化冷冻保护剂配方、添加微管稳定剂或抗氧化剂，但效果有限，亟需能够多靶点协同保护的新策略。

近年来，细胞外囊泡（Extracellular Vesicles, EVs）因其在细胞间通讯中的关键作用备受关注。作为携带蛋白质、核酸及代谢物等生物活性分子的脂质双层结构，EVs可介导应激适应性分子的传递，帮助细胞抵御逆境。卵泡液来源的EVs（Follicular Fluid-derived EVs, FF-EVs）已被证明能调控卵母细胞成熟与胚胎发育，但其在冷冻保护中的作用尚不明确。尤其值得注意的是，卵泡大小显著影响EVs的分子 cargo，例如小卵泡EVs富含促进细胞增殖的microRNA，而大卵泡EVs则更多参与炎症反应通路。然而，以往研究多在正常条件下进行，尚未有研究系统比较不同卵泡来源的EVs能否缓解冷冻应激带来的损伤。

为此，西班牙巴塞罗那自治大学与马德里国家农业食品研究技术中心等机构的研究团队在《Scientific Reports》发表论文，首次探究了FF-EVs对牛卵母细胞玻璃化冷冻效果的调控作用。研究通过尺寸排阻色谱法分离并表征了小卵泡（3–5 mm）与大卵泡（>9 mm）来源的FF-EVs，将其添加至卵母细胞体外成熟培养基中，随后对成熟卵母细胞进行玻璃化冷冻与复苏，并从纺锤体形态、DNA完整性、胚胎发育能力及囊胚质量等多角度评估冷冻保护效果。

研究团队运用多项关键技术：首先通过纳米颗粒跟踪分析、冷冻电镜与流式细胞术对FF-EVs进行粒径、浓度及表面标志物（CD81、CD9、CD63）鉴定；其次利用共聚焦显微镜观察PKH26标记的EVs在卵丘-卵母细胞复合体中的摄取情况；进而通过免疫荧光染色分析冷冻后卵母细胞的纺锤体结构与染色体排列，并采用TUNEL检测评估DNA碎片率；最后通过体外受精与胚胎培养系统评估囊胚形成率、扩张率、孵化率及细胞凋亡指数，并通过差异染色分析内细胞团与滋养层细胞数目。

FF-EVs的特征与卵母细胞摄取

纳米颗粒跟踪分析显示，小卵泡来源的EVs浓度更高、粒径更小，而大卵泡EVs粒径较大但浓度略低。冷冻电镜图像清晰展示了EVs的典型球形结构与脂质双层。

流式细胞术进一步证实了EVs膜完整性及tetraspanin标志物的表达。共聚焦显微镜观察发现，EVs在体外成熟9小时后即可出现在卵丘细胞的穿透明带突起及卵周隙中，21小时后广泛分布于卵丘细胞胞内，表明EVs能被有效内化并潜在作用于卵母细胞。

纺锤体形态与染色体稳定性

各组卵母细胞成熟至中期II的比率无显著差异，但玻璃化冷冻显著降低了正常纺锤体构型的比例，并增加了微管解聚与染色体分散的发生率。然而，添加大卵泡EVs的冷冻组纺锤体正常率与新鲜对照组无显著差异，且微管缺失率显著低于未添加EVs的冷冻组。

DNA完整性

TUNEL检测显示，冷冻显著提高了卵母细胞DNA碎片率，而添加大卵泡EVs的冷冻组碎片率显著低于其他冷冻组，且与新鲜组水平相当。小卵泡EVs则未表现出类似的保护作用。

胚胎发育潜能

在胚胎发育方面，大卵泡EVs预处理使冷冻卵母细胞的囊胚形成率、扩张率及孵化率均接近新鲜对照组，而小卵泡EVs组与单纯冷冻组发育率显著降低。差异染色进一步揭示，大卵泡EVs能更好地维持囊胚内细胞团细胞数，其凋亡率与新鲜组无差异。

结论与意义

本研究首次证实了大卵泡来源的FF-EVs通过保护纺锤体完整性、减少DNA损伤、提升胚胎质量，显著增强牛卵母细胞的冷冻耐受性。这一效应可能源于大卵泡EVs中特有的炎症反应通路相关分子（如PI3K-AKT、MAPK信号通路成分）对抗冷冻应激的协同作用。研究不仅为卵母细胞冷冻保存提供了新型生物制剂，还揭示了卵泡微环境EVs在生殖细胞应激保护中的生物学意义。未来需进一步解析EVs的具体活性分子机制，以期在人类生殖医学与濒危物种保护中实现转化应用。