综述：熏蒸提取法和ATP法估算微生物生物量——纪念Phil Brookes的综述

本综述系统评述了土壤微生物生物量估算的两种经典方法——熏蒸提取法（FE）和ATP测定法。作者强调FE法在多元素（C、N、P、S）同步检测方面的优势，同时呼吁 revitalize ATP（三磷酸腺苷）及 adenylates（腺苷酸）的测定作为快速、灵敏的替代方案。文章重新评估了ATP/MBC转化系数（中位数9.6 μmol g-1），并指出HPLC技术测得的adenylates/MBC比值（8.6 μmol g-1）更稳定。未来需关注细胞壁组分贡献及ATP提取标准化，以推动微生物生物量生态 stoichiometry（化学计量学）和能量状态（AEC）研究。

　　

背景

微生物是驱动土壤生物地球化学过程的核心力量，其生物量被视为土壤有机质（SOM）中“活跃的2%”，被Jenkinson喻为有机质输入的“针眼”。这一“针眼”在根际和残体圈等能量热点区域更为狭窄。微生物生物量碳（MBC）与基础呼吸、微生物残体（necromass）及土壤有机碳（SOC）存在定量关系，且对土地利用变化的响应比SOC更敏感。MBC作为“黑箱”指标，易于整合至周转模型（如RothC），并被农业从业者、政策制定者等广泛理解。

熏蒸提取法（FE）

原理与操作

FE法的核心是通过乙醇游离氯仿（CHCl₃）熏蒸24小时杀死微生物（经ATP测定验证），破坏细胞膜完整性但保留细胞包膜结构。熏蒸后，使用0.5 M K₂SO₄（土液比1:4）振荡提取30分钟，过滤后测定 fumigated 与 non-fumigated 样本的差值。高盐浓度可抑制NH₄⁺吸附和易分解组分降解。对于高有机质土壤（如泥炭、森林枯落物），提取液比例可增至1:30甚至1:100。

优势

FE法能清晰区分活体与死体微生物，覆盖细菌、古菌和真菌，且无需无菌操作。它可同步测定多种元素（C、N、P、S、K、Mg、Zn等）及同位素（¹³C、¹⁵N、¹⁸O、³⁴S），助力 stoichiometry 研究和碳利用效率（CUE）计算。此外，FE法适用于多种基质（堆肥、沉积物、水稻土甚至纯培养微生物），并可分析熏蒸液中的 ninhydrin-reactive N、氨基酸、糖类及多聚磷酸盐。

缺陷

FE需双样本提取，误差累积在低有机质土壤（如底土、沙漠土）中尤为突出。高背景氮、磷肥干扰MBN/MBP测定，TOC/TN分析仪成本高且操作敏感。熏蒸仅提取胞质组分（约45%细胞碳），难以评估细胞壁成分（几丁质、胞壁酸）。转化系数（k_EC、k_EN）受真菌/细菌比影响（真菌细胞大、更易溶），但实际误差因菌群比例相对稳定而可控。

三磷酸腺苷（ATP）法

提取与测定挑战

ATP测定需高效提取并避免水解或吸附。早期TCA/paraquat法因毒性被弃用，改用TCA/imidazole（Redmile-Gordon等2011）。HPLC法（Dyckmans和Raubuch 1997）基于碱性Na₃PO₄/DMSO/EDTA提取，可同步测ATP、ADP、AMP并计算腺苷酸能量电荷（AEC = (ATP + 0.5 × ADP) / (ATP + ADP + AMP)）。新兴沸水提取法（Bochdansky等2021）最小化酶干扰，适配发光法（如CellTiter-Glo 2.0）或LuciPac A3试剂盒（测总腺苷酸）。

优势与局限

ATP法灵敏度高、无需预培养，可测深至20米的底土或节肢动物肠道等微样本。ATP仅存于活细胞，不受腐殖质干扰。但植物根系会污染结果，且提取标准化不足（如吸附损失）。当前研究兴趣下降，亟需方法优化（如加标回收实验）。

ATP/MBC比值再评估

细胞ATP浓度受严格调控，与生长条件、分类群无关。Jenkinson（1988）报道TCA/paraquat法的ATP/MBC均值为11.7 μmol g^-1。Contin等（2001）汇总209个观测值，均值为10.6 ± 3.2 μmol g^-1。本文汇总15项TCA/imidazole研究（61个观测值），加权中位数为9.6 μmol g^-1（范围2.6–22），与TCA/paraquat法一致。

HPLC法（Dyckmans和Raubuch 1997）的21项研究（165样本）显示，ATP/MBC中位数5.8 μmol g^-1，腺苷酸/MBC中位数8.6 μmol g^-1（ATP占总腺苷酸68%）。该比值受土地利用影响：耕地（5.8 μmol g^-1）显著高于种植园和森林（表1）。热带土壤磷限制导致低ATP/MBC和高MB-C/N比。土壤pH、黏粒含量及MB-C/N、MBC/SOC比值也显著影响ATP浓度（表2）。稳态转换因子推荐7.9 μmol ATP g^-1 MBC（250 g MBC g^-1 ATP），与藻类、浮游生物数据吻合。

未来展望

微生物生物量是土壤关键指标，FE法凭借其多元素检测能力仍将主导研究，尤其助力元素 stoichiometry（如S、K、Mn、Zn）和 necromass 对SOM贡献的探索。ATP/腺苷酸测定需标准化沸水提取、优化酶法检测、简化HPLC系统，以实现廉价、快速、高灵敏的MBC估算（尤其低有机质土壤）。联合FE、ATP、细胞膜组分（PLFA）及分子工具将深化微生物群落与生物地球化学循环的认知。