可溶性重组肠道病毒71型VP1蛋白融合截短新城疫病毒核蛋白激发小鼠免疫反应的研究

本刊推荐：为解决EV71引发的手足口病及其严重神经系统并发症，研究人员开展可溶性重组NPt-VP1198-297融合蛋白的免疫原性研究。结果表明该蛋白能显著诱导小鼠产生高水平抗VP1 IgG抗体及Th1/Th2混合免疫应答，为开发安全有效的EV71亚单位疫苗提供了重要实验依据。

　　

在儿童传染病防控领域，肠道病毒71型（Enterovirus 71, EV71）一直是令人闻之色变的病原体。作为手足口病（Hand, Foot and Mouth Disease, HFMD）的主要元凶，它不仅会引起发热和皮疹，更可怕的是可能攻击神经系统，导致脑膜炎、急性弛缓性麻痹等严重并发症，甚至造成死亡。近年来，亚太地区多次爆发EV71疫情，2012年柬埔寨疫情导致近60名儿童死亡，2008-2013年间中国报告超过900万病例，其中90%的死亡病例由EV71引起。虽然2015-2016年中国批准了两款灭活EV71疫苗，但灭活疫苗存在潜在风险，包括灭活不彻底或毒力回复等，这使得安全性更高的亚单位疫苗成为研究热点。

在EV71的结构蛋白中，病毒蛋白1（VP1）因其包含主要抗原中和表位而备受关注。特别是其C端区域（氨基酸198-297）含有保守的SP70中和表位，能诱导产生强效的中和抗体。然而，重组蛋白表达常常面临溶解度低的难题，影响其免疫效果。为了解决这一问题，马来西亚Putra大学的研究团队创新性地将EV71 VP1片段与新城疫病毒（Newcastle Disease Virus, NDV）的截短核蛋白（NPt）融合，成功获得了可溶性重组蛋白，并在小鼠模型中验证了其免疫效果，相关研究成果发表在《Brazilian Journal of Microbiology》上。

研究人员采用分子生物学技术构建了pTrcHis2-NPt-VP1_198-297表达载体，使用大肠杆菌表达系统制备可溶性（SP）和不可溶性（IB）两种形式的融合蛋白。通过组氨酸标签亲和层析纯化后，使用SDS-PAGE和Western blot验证蛋白表达。选用BALB/c小鼠分为三组，分别免疫SP制剂、IB制剂和PBS对照，采用弗氏佐剂乳化，进行初免和两次加强免疫。通过间接ELISA检测血清抗VP1 IgG抗体水平，BrdU增殖实验分析脾淋巴细胞增殖能力，流式细胞术检测Th1/Th2细胞因子谱。

可溶性NPt-VP1t重组蛋白的纯化

研究人员使用HisTrap HP柱成功纯化了可溶性NPt-VP1t蛋白。SDS-PAGE和免疫印迹分析显示，在500 mM咪唑洗脱的第五组分（E5）中出现了明显的约59 kDa条带，与预期大小一致，证实了目标蛋白的成功纯化。Western blot使用抗His抗体进一步验证了该条带为His标签的NPt-VP1t融合蛋白。

198-297蛋白可溶性组分的纯化'>

包涵体形式NPt-VP1t的纯化与复性

不可溶性蛋白在8 M尿素条件下纯化，SDS-PAGE显示在第一洗脱组分（E1）中出现清晰的59 kDa条带。Western blot分别使用抗VP1和抗NDV抗体进行验证，均检测到目标条带，证实了NPt-VP1t蛋白的成功回收。然而，该组分中存在共纯化的杂质蛋白，经密度计量分析表明，实际NPt-VP1t蛋白含量约为7μg，其余为其他蛋白。

NPt-VP1t在小鼠中的免疫原性

小鼠体重监测显示，免疫重组蛋白未对小鼠正常生理过程产生显著影响。血清学分析表明，可溶性NPt-VP1t蛋白能诱导更强的抗VP1 IgG反应。首次加强免疫后（第4周），SP组的抗体水平约为IB组的2倍，最高应答出现在第8周。SP组抗体水平在末次免疫后至少维持两周高位，显著高于IB组和对照组。

细胞免疫应答

脾淋巴细胞增殖实验显示，SP组的刺激指数（S.I.）为0.826±0.104，比IB组高约1.6倍，表明可溶性蛋白能更有效激活T细胞免疫。

细胞因子产生

细胞因子分析显示，SP组小鼠产生显著更高水平的Th1（IFN-γ、IL-2）和Th2（IL-4、IL-6、IL-10）细胞因子，而TNF-α水平无显著差异，表明疫苗接种未诱导过度炎症反应，成功激活了平衡的Th1/Th2免疫应答。

研究结论与讨论部分指出，可溶性NPt-VP1t重组蛋白能激发强烈的小鼠体液和细胞免疫反应，效果显著优于不可溶形式。该蛋白诱导了平衡的Th1/Th2型免疫应答，其中IFN-γ的产生对抗病毒防御尤为重要。这些发现强调了蛋白溶解度在亚单位疫苗设计中的重要性，可溶性NPt-VP1t蛋白是很有前景的EV71疫苗候选物。需要注意的是，所有免疫制剂均使用弗氏佐剂，可能掩盖疫苗本身的安全性特征；且IB组实际抗原剂量较低并含有杂质蛋白，可能影响免疫效果评估。未来研究需进行病毒中和实验和攻毒实验以验证保护效果，并考虑使用更适合临床的佐剂系统。