靶向PRAME pMHC的T细胞衔接器在实体瘤治疗中的开发与应用

本综述系统阐述了靶向PRAME pMHC（肽-主要组织相容性复合物）的T细胞衔接器（TCE）在实体瘤治疗中的突破性进展。通过创新性筛选策略发现高选择性TCR模拟（TCRm）抗体，并利用冷冻电镜（cryoEM）验证其类TCR结合模式，为克服实体瘤治疗中靶向毒性难题提供了新方案。

　　

引言

T细胞衔接器（T cell engager, TCE）作为双特异性抗体，通过同时结合肿瘤细胞上的肿瘤抗原和T细胞上的T细胞受体（TCR）CD3亚基，诱导T细胞介导的肿瘤细胞杀伤。在血液肿瘤治疗中，TCE已显示出显著的临床效益和完全缓解，证明了这种治疗模式的变革潜力。然而，实体瘤相关抗原（tumor-associated antigens, TAAs）（如EpCAM、EGFR、CEA或HER2）在正常组织中的表达水平足以导致健康组织的细胞毒性，这种靶向、非肿瘤毒性长期阻碍了TCE在实体瘤中实现与血液恶性肿瘤相同的深度和持久抗肿瘤反应。

为应对这些临床挑战，寻找具有更高安全性和更宽治疗窗口的实体瘤TAAs已转向癌症睾丸抗原（cancer testis antigens, CTAs）等靶点，这些抗原具有更好的肿瘤特异性。CTAs包括200多种蛋白质，其表达限于睾丸和胎盘，但由于恶性细胞中表观遗传和转录过程失调，在癌症中异常表达。CTA表达最常见于黑色素瘤、膀胱癌、肺癌和血液恶性肿瘤，在肾癌和结肠癌中频率较低。CTAs（包括MAGE、NY-ESO-1和PRAME）通过影响细胞分裂、凋亡逃逸、上皮间质转化调控、转移和肿瘤微环境调节等机制促进肿瘤生长和进展，使其成为有吸引力的治疗靶点。

大多数CTAs在细胞内表达，因此除了作为自身肽在主要组织相容性复合物（major histocompatibility complex, MHC）背景下呈现在细胞表面外，无法作为表面抗原被TCE接触。肽-MHC（peptide-MHC, pMHC）复合物传统上被T细胞上的TCR识别，当免疫原性肽被呈递并被表达同源TCR的T细胞识别时，可以驱动免疫反应。这种T细胞识别pMHC的机制已通过CTA肽疫苗接种方法（可引发抗肿瘤体液反应）或通过工程化表达特异性识别CTA肽的TCR的嵌合抗原受体T细胞（chimeric antigen receptor T cells, CAR-T）（TCR-T细胞）被用于开发癌症治疗。

Tebentafusp（KIMMTRAK?）是一种重组表达和亲和力成熟的gp100靶向TCR，与抗CD3结合结构域（ImmTAC）融合，已被批准用于治疗转移性葡萄膜黑色素瘤，代表了靶向CTAs的现成生物制剂TCE治疗新类别的首例。然而，重组TCRs在药物开发过程中面临挑战，包括热稳定性差、糖基化程度高以及通常微摩尔级的亲和力。尽管通过引入稳定突变和提高亲和力至皮摩尔范围已有进展，生产仍然是一个挑战。

TCR模拟（TCR-mimic, TCRm）抗体是规避通常与重组TCR开发相关的复杂性的一种替代方法。抗体通常具有热稳定性，缺乏可变区糖基化位点，具有纳摩尔级结合亲和力，并且可以使用传统工艺生产。越来越多的TCRm抗体被用于靶向pMHC CTAs。

PRAME作为实体瘤靶点的表征

PRAME（Preferentially Expressed Antigen in Melanoma）是一种癌症睾丸抗原，在多种实体瘤中高度表达，而在正常组织中表达有限，使其成为低靶向、非肿瘤毒性风险的有希望的实体瘤靶点。通过生物信息学分析，PRAME在乳腺癌、肺癌、头颈癌和血液恶性肿瘤中的RNA转录本丰度一致较高，且在正常组织中几乎无表达。免疫组织化学（immunohistochemistry, IHC）染色证实，35-70%的肿瘤样本PRAME表达阳性，表达异质性因适应症而异，肺腺癌（lung adenocarcinoma, LUAD）和三阴性乳腺癌（triple-negative breast cancer, TNBC）样本中表达最均质，头颈鳞状细胞癌（head and neck squamous cell carcinoma, HNSCC）样本中最异质。所有PRAME阳性样本均表达HLA-A，超过50%的肿瘤样本在肿瘤和基质中均表达HLA-A。

通过定量质谱分析，从MHC免疫沉淀和洗脱的表面呈递肽中量化了六种PRAME肽（PRAME₁₀₀、PRAME₁₄₂、PRAME₃₀₀、PRAME₃₇₁、PRAME₃₉₄和PRAME₄₂₅）的丰度。PRAME₄₂₅肽在至少六种癌症细胞系中检测到，平均表面密度高于PRAME₃₉₄，因此选择PRAME₄₂₅ pMHC作为治疗靶点。

高选择性抗PRAME pMHC抗体的鉴定

由于只有九或十个氨基酸的肽将目标pMHC与所有其他脱靶pMHC区分开，因此发现高选择性抗pMHC抗体非常困难。为最大化序列多样性和提高肽选择性抗体的命中率，使用纯化的重组人HLA-A02:01 MHC和PRAME₄₂₅肽（PRAME₄₂₅ pMHC）复合物免疫多种物种（包括Lewis大鼠、野生型C57BL/6小鼠、野生型BALB/c小鼠、Trianni人源化小鼠和Alloy人源化小鼠）。通过微流控单B细胞筛选分析抗体与PRAME₄₂₅ pMHC和脱靶肽MAGE-A4₂₃₀（加载到相同人HLA-A02:01 MHC中）（MAGE-A4₂₃₀ pMHC）的结合，以识别和消除非肽选择性结合剂。

从160万个B细胞中筛选出约250个唯一抗体序列，这些序列仅结合目标PRAME₄₂₅ pMHC。对所得序列进行互补决定区H3（complementarity-determining region H3, CDR-H3）多样性分析，基于75%同一性分类克隆家族和唯一抗体。总共131个唯一抗体被格式化为Fabs并纯化用于进一步筛选。

为在细胞背景下评估每个Fab的特异性和效力，使用T2淋巴母细胞系进行了多重目标和脱靶结合测定。T2细胞表达HLA-A但缺乏抗原加工和呈递，有利于专门呈递外源目标肽。将131个唯一Fabs与肽脉冲的T2细胞孵育，并通过流式细胞术分析评估目标与脱靶细胞结合。在筛选的131个Fabs中，27个不结合或结合较弱（EC₅₀ >11 nM）于PRAME₄₂₅肽脉冲的T2细胞；27个被认为非选择性，因为它们以EC₅₀ <200 nM结合MAGE-A4₂₃₀肽脉冲的T2细胞；77个被认为具有选择性，因为它们有效（EC₅₀ <11 nM）结合目标PRAME₄₂₅肽脉冲的T2细胞，并且与脱靶MAGE-A4₂₃₀肽脉冲的T2细胞具有>20倍的EC₅₀窗口。

为阐明77个PRAME₄₂₅选择性Fabs的大致结合足迹，通过将Fabs与携带PRAME₄₂₅亲本序列或每个位置单点丙氨酸突变的肽脉冲T2细胞孵育，进行丙氨酸扫描，以识别和消除当格式化为TCEs时在T细胞依赖性细胞毒性（T cell dependent cellular cytotoxicity, TDCC）测定中可能非选择性的结合剂。理想情况下，高选择性抗体应以“类TCR”几何结构识别PRAME₄₂₅ pMHC，通过结合肽的中心并与多个肽残基形成大部分结合接触。因此，我们试图排除“末端结合剂”（即那些仅与肽的N或C末端残基接触的抗体），这些抗体可能通过过度贡献与MHC的接触或具有最少的肽残基接触，从而增加与PRAME₄₂₅具有序列相似性的人类蛋白质组肽结合的风险。

确实，ESK1抗体的高亲和力结合主要由MHC相互作用驱动，并且ESK1抗体可以识别来自人类蛋白质组的具有同源N末端氨基酸的肽。因此，如果单个丙氨酸突变仅在前四个N末端或最后四个C末端氨基酸位置将抗体结合降低到<60%的野生型PRAME₄₂₅肽，则抗PRAME₄₂₅ pMHC Fab被认为是“末端结合剂”。类似地，如果对<4个位置的丙氨酸突变敏感，则Fab被认为非选择性。与此一致，先前活动中发现的抗体PR-19作为对照分子包含在我们的TDCC测定中，因为它在丙氨酸扫描测定中表现出“末端结合剂”几何结构，并介导PRAME阴性细胞系U87MG的脱靶杀伤。

如果对跨越中间四个残基（位置3-6）的≥4个位置的丙氨酸突变敏感，则Fab被认为具有类TCR结合足迹。然而，如果它们的结合EC₅₀ <1 nM，>2个TCR面对位置（P1/P4/P5/P8）的丙氨酸突变将结合降低>60%，并且它们不结合脱靶MAGE-A4₂₃₀肽，则对<4个位置敏感的Fabs也被包括在内。在丙氨酸扫描测定中筛选的77个命中中，37个满足类TCR结合足迹的标准，其中25/37个形成≥4个接触，12/37个形成<4个接触。

尽管我们预期丙氨酸扫描测定能富集选择性结合剂，但我们预计即使在我们低灵敏度的丙氨酸扫描测定中具有类TCR结合足迹的抗体，在更高灵敏度的TDCC测定中仍会介导脱靶杀伤，表明这些抗体尽管具有“类TCR”结合足迹，仍然对MHC结合有过度贡献。确实，从总共37个已识别的PRAME pMHC抗体中，仅四个没有脱靶杀伤倾向。这四个先导抗体在X扫描表位映射测定中进一步评估以确定结合混杂性，证实了抗体的类TCR结合模式。

TCE的最佳效力取决于多个额外因素，包括目标表位、靶向臂的亲和力和格式以及分子价态。对于丰富的表面表达TAAs（如CEA），由两个CEA结合scFvs和一个scFv CD3靶向臂组成的2+1 TCE格式显示出相对于单价（1+1）scFv-scFv格式以及2+1和1+1 Fab-based TCEs的效力增强。这种增加的效力可能归因于 avidity 效应驱动两个CEA靶向臂的功能亲和力增强，以及较小scFv CD3和CEA结合剂之间的域间距离减小，导致效应细胞和靶细胞之间的接近度增加。

相比之下，CTA肽-MHC（pMHC）抗原在细胞表面的丰度远低于常规TAAs，观察到的频率从每个细胞几十到几百个肽不等。在这种情况下，由于抗原密度降低导致单个目标分子之间的空间分离更大，基于 avidity 的TCE可能效果较差。在针对pMHC抗原WT1的不同TCE格式评估中，Walseng等人确定，TCE通过抗pMHC和抗CD3臂之间的几何构象诱导人工免疫突触形成的能力，而不是 avidity 驱动的靶向接合，负责针对此目标类别的最佳效力。与此一致，我们比较了多个1+1和2+1 TCE格式，发现针对PRAME₄₂₅肽的2+1格式相对于1+1格式没有产生额外的效力益处。

先导抗体HU-38的结构分析

为了理解HU-38克隆对pMHC识别的要求，我们通过冷冻电镜（cryoEM）以2.72 ?分辨率确定了HU-38 Fab/PRAME₄₂₅ pMHC复合物的结构。通过尺寸排阻色谱（size exclusion chromatography, SEC）纯化Fab:pMHC复合物，然后与过量抗Kappa VHH复合以增加分子量并刚性化Fab。在cryoEM结构中，界面的pMHC和CDR残基在密度中解析良好，允许分析特定接触。

HU-38以线性或“类TCR”几何结构与PRAME pMHC结合，并与PRAME₄₂₅肽的多个残基形成接触。HU-38抗体与PRAME肽的接触主要由重链CDRs（CDR1和CDR3）形成，而轻链CDRs大部分与MHC形成接触。重链CDR1残基Y32通过氢键和堆积与肽残基Q4和H5相互作用。重链CDR3残基E97与肽残基Q4和L6形成直接氢键，而残基I98和H99与肽形成水介导接触。此外，重链CDR3的多个残基与肽形成堆积接触（例如，CDR3 H99与肽I7）。

除了与PRAME肽形成直接接触外，重链残基E97与MHC残基R65形成盐桥相互作用，如其他一些TCRm抗体中所观察到的。有趣的是，HU-38轻链CDRs中仅一个残基与PRAME₄₂₅肽形成直接接触：轻链CDR1的W32与肽残基G8堆积。轻链CDR1在四个先导抗体中100%保守，W32与肽残基G8之间的接触可能解释了在该肽位置对甘氨酸的严格偏好。另一个轻链CDR残基F94位于肽残基I7附近，但不形成直接接触。然而，F94与重链CDR3残基H99直接相互作用，后者直接接触肽残基I7。这两个CDR残基可能解释了HU-38在该肽位置对异亮氨酸的严格偏好。虽然四个先导抗体的CDR-H3序列不同，但轻链CDR-H3残基F94是保守的，并且可能有助于四个先导抗体对肽位置7的不同但严格偏好。总体而言，在HU-38复合物结构中观察到的“类TCR”结合与此先导的X扫描谱一致，该谱显示了沿PRAME肽长度多个位置的肽序列选择性。

讨论

蛋白质表达水平的差异、细胞内抗原（如CTAs）的蛋白酶体降解以及肽对MHC的亲和力驱动了肽抗原在细胞表面的可变展示。我们使用靶向定量质谱确定了从癌症细胞系MHC免疫沉淀和洗脱的六种PRAME肽的丰度，并发现它们在细胞系中以可变密度展示，PRAME₃₉₄和PRAME₄₂₅肽在评估的癌症细胞系中以最高丰度展示。因此，仔细选择具有高抗原密度的pMHC靶点可能有助于设计最佳效力的TCE。使用类似的方法，通过质谱分析来自多个实体瘤适应症的代表性细胞系和原代样本中pMHC免疫沉淀呈递的肽，Ribeiro等人在他们描述PRAME₄₂₅肽优势的报告中证实了我们的发现。虽然T细胞可以通过识别每个细胞仅2-10个pMHC介导靶细胞杀伤，但杀伤效力随着抗原密度的增加而增加。确实，我们发现抗PRAME₄₂₅ pMHC TCEs对展示约100个PRAME₄₂₅肽每个细胞（NCI-H1755）的细胞的杀伤效力比对展示仅约20个PRAME₄₂₅肽每个细胞（SAOS-2）的细胞强约10倍。

尽管CTA pMHC靶点通常由于在正常组织中高度限制的表达模式而与改善的安全性相关，但与无关pMHC复合物结合导致的严重不良事件风险难以预测，并突出了彻底脱靶筛选的必要性。2013年，一项针对CTA MAGE-A3的EVDPIGHLY肽的CAR-T临床试验因两名患者因对心脏组织的脱靶活性死亡而终止。虽然未在心脏中检测到MAGE-A3蛋白，但后来发现仅在来自诱导多能干细胞的搏动心肌细胞培养物中可检测到的肌肉蛋白 Titin 的表达是类似肽ESDPIVAQY的来源，导致分子模拟和Titin pMHC肽被MAGE-A3 CAR-T识别。

为预测这种潜在的毁灭性脱靶相互作用，设计了一个复杂的筛选级联以仅识别高选择性抗PRAME₄₂₅ pMHC先导。形成少量肽接触或仅结合肽N或C末端的结合剂（例如“末端结合剂”）与通过过度识别MHC而脱靶结合的较高可能性相关。与此一致，当格式化为TCE时，PR-19“末端结合剂”介导PRAME阴性细胞的脱靶杀伤。我们使用丙氨酸扫描结合测定评估抗体表位，以富集更可能具有选择性杀伤谱的结合剂，使得形成少量肽接触或仅结合肽N或C末端的结合剂被排除在进一步评估之外。我们预期即使在我们低灵敏度的丙氨酸扫描测定中具有类TCR结合足迹的抗体，在更高灵敏度的TDCC测定中仍会介导脱靶杀伤，表明这些抗体尽管具有“类TCR”结合足迹，仍然对MHC结合有过度贡献。确实，从总共37个已识别的PRAME pMHC抗体中，仅四个没有脱靶杀伤倾向。这四个先导抗体在X扫描表位映射测定中进一步评估以确定结合混杂性，证实了抗体的类TCR结合模式。

TCE的最佳效力取决于多个额外因素，包括目标表位、靶向臂的亲和力和格式以及分子价态。对于丰富的表面表达TAAs（如CEA），由两个CEA结合scFvs和一个scFv CD3靶向臂组成的2+1 TCE格式显示出相对于单价（1+1）scFv-scFv格式以及2+1和1+1 Fab-based TCEs的效力增强。这种增加的效力可能归因于 avidity 效应驱动两个CEA靶向臂的功能亲和力增强，以及较小scFv CD3和CEA结合剂之间的域间距离减小，导致效应细胞和靶细胞之间的接近度增加。

相比之下，CTA肽-MHC（pMHC）抗原在细胞表面的丰度远低于常规TAAs，观察到的频率从每个细胞几十到几百个肽不等。在这种情况下，由于抗原密度降低导致单个目标分子之间的空间分离更大，基于 avidity 的TCE可能效果较差。在针对pMHC抗原WT1的不同TCE格式评估中，Walseng等人确定，TCE通过抗pMHC和抗CD3臂之间的几何构象诱导人工免疫突触形成的能力，而不是 avidity 驱动的靶向接合，负责针对此目标类别的最佳效力。与此一致，我们比较了多个1+1和2+1 TCE格式，发现针对PRAME₄₂₅肽的2+1格式相对于1+1格式没有产生额外的效力益处。

HU-38与其目标pMHC形成的复合物的结构表征证实了位于PRAME₄₂₅肽中心氨基酸Q4–G8的最佳结合相互作用。TCRs通常以“头对头”或“线性”结合几何结构与pMHCs接合，确保与呈递肽的广泛接触表面。TCR结合几何结构被认为受到与pMHC共同进化和/或与信号复合物形成的结构兼容性的限制。然而，对于pMHC结合抗体，没有这种约束起作用。在此描述的筛选级联中，通过目标和脱靶pMHC的结合实验发现了具有类TCR结合的先导抗体，并且通过cryoEM为先导HU-38证实了这种结合模式。四个高选择性先导HU-08、HU-19、HU-38和HU-58具有88%的整体序列同一性，具有相同的CDR-H3长度，并共享相同的重链（IGHV4-59）和轻链（IGKV1-12）种系使用。这四个抗体的轻链具有更高的序列同一性，92.5%的整体序列同一性，并且所有轻链CDRs中仅一个氨基酸差异（F96或Y96，无MHC接触）。虽然“头对头”抗体:pMHC结合可能对于实现选择性pMHC接合是必要的，但与肽残基接触的精确性质也将在pMHC结合选择性中起关键作用。尽管序列同源性高，但四个先导在结合混杂性上仍然不同，HU-19和HU-38显示出与人类蛋白质组中同源肽序列结合的可能性最小。与PRAME₄₂₅肽的大部分氨基酸接触由HU-38的CDRs H1和H3形成。HU-08、HU-19、HU-38和HU-58之间的主要差异在于CDR-H3，它们共享不到75%的序列同源性。因此，在这组抗体中观察到的肽混杂性可能由CDR-H3驱动。

总之，我们证明PRAME是高度癌症选择性的，因为它在许多液体和实体瘤中表达，而在正常组织中的表达仅限于非必需器官。由于PRAME的细胞内表达，我们进一步量化了几种PRAME衍生MHC肽的表面表达密度，并选择PRAME₄₂₅肽作为TCE抗肿瘤靶点，因为相对于其他PRAME衍生MHC肽丰度增加。最后，我们发现了四个选择性抗PRAME₄₂₅抗体，当格式化为双特异性TCE时，仅介导PRAME阳性癌细胞的选择性杀伤。由于MHC结合模式的风险，这些分子需要通过额外测定（如原代细胞染色以测试脱靶反应性和B淋巴母细胞系染色以评估同种异体反应性）进一步评估安全性。虽然几种抗PRAME生物制剂正在临床评估中，但这些疗法源自亲和力成熟的重组TCRs，我们的抗体代表了一类新型的抗PRAME pMHC生物制剂。