iBody介导的合成细胞因子受体激活调控：基于纳米抗体界面工程的理性设计

本研究通过理性设计纳米抗体框架突变，构建了具有自组装能力的iBody结构，成功实现了合成细胞因子受体的可调控激活。该系统通过降低受体间距离促进gp130ICD二聚化，显著增强JAK-STAT信号传导，为CAR-T细胞治疗和合成生物学提供了新型分子工具。

　　

引言

纳米抗体（Nanobody）作为源自骆驼科动物重链抗体的单域抗体片段，凭借其高结合亲和力、小分子量、优异稳定性及灵活表位识别能力，已成为分子生物学和治疗应用领域的重要工具。本研究聚焦于纳米抗体与合成细胞因子受体的融合构建，通过理性设计纳米抗体框架突变，调控受体激活特性。

融合受体构建与初始表征

研究团队将gp130特异性纳米抗体（GP01、GP11、GP13、GP20）与gp130受体的跨膜区和细胞内域（gp130_ICD）融合，构建了合成细胞因子受体。这些受体在HEK293T细胞中能够表达并结合可溶性gp130-Fc（sgp130-Fc），但无法诱导STAT3磷酸化，表明受体间距离可能过大导致激活失败。

iBody突变引入与功能验证

受天然广泛中和抗体DH851.3的启发，研究人员在GP11纳米抗体框架中引入了8个关键突变，形成i-shaped纳米抗体二聚体（iBody）。AlphaFold建模显示这些突变通过疏水相互作用促进纳米抗体二聚化。将突变体iGP11与gp130_ICD融合后，在Ba/F3细胞中实现了配体依赖的受体激活：sgp130-Fc以0.84±0.39 nM的EC₅₀诱导STAT3磷酸化和细胞增殖。值得注意的是，iGP11-gp130受体表现出配体非依赖性组成型激活，JAK抑制剂P6能够以124.37±18.24 nM的IC₅₀抑制这种自增殖活性。

结构优化与功能调控

通过结构模型指导，研究人员进一步开发了减少突变数量的变体：iGP11-Reduced（5个突变）和iGP11-Minimal（4个突变）。PRODIGY预测显示这些变体的二聚化亲和力逐渐降低（K_d值分别为6.13±5.31 μM和34.25±22.17 μM）。实验证实减少突变确实降低了配体非依赖性激活，同时保留了配体依赖的激活能力。时间动力学分析显示，减少突变变体的STAT3磷酸化峰值出现延迟，且表现出更正常的负反馈调节。

受体相互作用机制研究

在表达内源性gp130的Ba/F3-gp130细胞中，所有纳米抗体融合受体均表现出强烈的自增殖表型，表明受体与内源性gp130形成异源二聚体。共培养实验排除了细胞间相互作用（juxtacrine）的可能性，竞争实验使用可溶性GP11-Fc证实了细胞膜上异源二聚体的形成。

系统通用性验证

研究团队将iBody突变策略应用于靶向帕利珠单抗（palivizumab）的抗独特型纳米抗体AIP3。在Ba/F3细胞中，iAIP3-gp130受体能够被帕利珠单激活（EC₅₀=2.71-17.21 nM），而野生型AIP3-gp130则无此功能。减少突变变体同样表现出延迟的激活动力学和降低的组成型活性，证明了iBody策略的通用性。

讨论与应用前景

本研究开发的iBody技术平台通过精细调控纳米抗体框架的相互作用能力，实现了合成细胞因子受体的可编程激活。这种策略不仅适用于gp130信号系统，还可推广至其他需要二聚化激活的受体系统，如干扰素γ信号通路和CAR-T细胞设计。特别是基于帕利珠单抗的激活系统，由于该抗体已获批临床使用且安全性良好，为未来体内应用提供了理想平台。

研究局限性

基于抗gp130纳米抗体的构建体主要作为受体工程研究的模型系统，由于gp130在几乎所有细胞类型中普遍表达，这些构建体不太适合翻译应用（如CAR-T细胞治疗）。靶向帕利珠单抗的抗独特型纳米抗体可能更适合体内应用，但需要进一步研究验证。

材料与方法

研究使用Ba/F3、HEK293T和Phoenix-Eco细胞系，通过逆转录病毒转导表达纳米抗体融合受体。蛋白质表达使用ExpiCHO^TM系统，通过Protein A亲和色谱纯化。功能实验包括增殖测定、细胞内STAT3/pSTAT3染色、Western blot分析和免疫荧光结合测定。计算建模使用AlphaFold 2和ColabFold进行，结合PRODIGY和DDMut-PPI进行结合能预测和界面分析。