基于共聚焦拉曼显微镜的细胞内代谢互作原位半定量成像技术揭示深海贻贝内共生机制

本研究针对深海贻贝-甲烷氧化菌内共生系统中代谢互作机制难以解析的难题，开发了基于内标法的多变量半定量成像方法，通过共聚焦拉曼显微镜(CRM)实现了多种代谢物的同步亚细胞分布解析。研究发现共生菌株存在基于糖原丰度的生态位驱动代谢策略分化，并首次提供共生菌可能为宿主提供胆固醇合成中间体的直接证据，为研究不可培养微生物的代谢互作提供了强大的非侵入性工具。

　　

在深邃的海洋深处， hydrothermal vents（热液喷口）和 cold seeps（冷泉）中生活着一种特殊的生物——深海贻贝 Gigantidas platifrons。它们的鳃细胞里居住着数百个甲烷氧化细菌，这些内共生菌能够通过甲烷氧化作用为宿主提供有机碳，甚至可能合作完成固醇类物质的合成。然而，由于这些共生菌无法被人工培养，科学家们一直难以揭示其共生互作的具体分子机制。更棘手的是，传统的代谢物检测技术存在明显局限：质谱成像技术虽然能够实现无标记的多重检测，但其空间分辨率通常仅限于微米级别，难以追踪亚细胞尺度的代谢过程，而且会对珍稀的深海生物样本造成破坏。

面对这些挑战，中国科学院海洋研究所的张鑫团队及其合作者开发了一种突破性的成像方法。他们在《iScience》杂志上发表了题为"In situ semi-quantitative imaging of intracellular metabolic interaction by confocal Raman microscopy"的研究论文，利用共聚焦拉曼显微镜(Confocal Raman Microscopy, CRM)的高空间分辨率（约350纳米），结合多变量半定量分析(Multivariate semi-quantitative analysis, MQA)方法，首次实现了对不可培养微生物细胞内代谢互作的原位、无损、多代谢物同步成像分析。

研究人员主要采用了以下关键技术方法：首先从南海冷泉区采集深海贻贝样本并进行实验室培养去共生处理；利用共聚焦拉曼显微镜进行亚细胞级空间扫描成像，结合K-means聚类和真成分分析等多变量算法解析细胞组分；建立内标法定量模型（以苏氨酸1341 cm^-1峰为内参），实现对胆固醇、糖原、角鲨烯等多种代谢物的半定量比较；通过荧光原位杂交(FISH)、透射电镜(TEM)和代谢组学数据对拉曼成像结果进行多重验证。

CRM在G. platifrons鳃细胞中的应用开发

研究团队建立了一套完整的工作流程（图1），首先建立了G. platifrons鳃细胞主要代谢物的拉曼光谱库，包括碳水化合物、氨基酸和固醇等（表S1）。由于 bacteriocytes（含菌细胞）的生物化学组成比哺乳动物细胞更为复杂和异质，且含有核酸的共生菌分布在细胞质中，使得细胞分区变得困难。研究人员采用结合K-means聚类和真成分分析的多元分析策略，能够考虑多个拉曼峰的小幅差异，从而获得更好的恢复率和准确性。

为了解决拉曼散射截面差异带来的定量难题，研究团队开发了拉曼峰面积成像归一化方案，通过计算拉曼光谱的归一化峰面积（峰面积比）来估算生物分子的丰度，即A_代谢物/A_内标=△A。研究人员发现1341 cm^-1的拉曼峰（初步认定为苏氨酸）符合内标分子的要求：分布均匀且含量稳定。统计分析和代谢组学结果证实，即使 after de-colonization（去定植）后，苏氨酸的含量相对于其他代谢物变化不显著。

鳃细胞的高分辨率CRM成像

基于多变量代谢分析，原位 bacteriocytes 被聚类为五个类别（图2）。红色簇位于细胞基部，具有约1078 cm^-1（对应PO₂^-伸缩）和1423 cm^-1（代表脱氧核糖）的拉曼峰，表明该区域为细胞核；黄色簇为核附近的小点，具有约1746 cm^-1的特征信号（与C=O振动相关），代表 triglycerides（甘油三酯），表明这些是 lipid droplets（脂滴）；蓝色簇填充整个细胞，特征峰在约1006 cm^-1，初步代表 phenylalanine（苯丙氨酸），推断为细胞质；绿色和青色簇位于细胞核对面，具有显著信号，初步归因于 lanosterol（羊毛固醇）在约930、943和1643 cm^-1，以及 squalene（角鲨烯）在约1379和1666 cm^-1。由于角鲨烯等类固醇前体是I型甲烷氧化菌的标志，因此这两个簇代表共生菌。

微生物介导的宿主细胞内代谢过程分析

利用CRM提供的精密的亚细胞分辨能力和多代谢通路分析能力，研究人员发现共生菌可以根据糖原含量细分为两种表型类别（图3）。位于外层区域的共生菌（A型）比其他区域的共生菌表现出更高的糖原浓度（表S1、S2；图2A、3C、S6）。这种糖原的空间分布反映了潜在代谢功能的差异。扫描电镜成像证实了 bacteriocytes 中共生菌的不同代谢状态，外层细胞中聚集的微小电子致密颗粒符合糖原的特征。

去共生过程中鳃细胞的半定量拉曼成像

基于对鳃细胞的初步分析，研究人员进一步可视化了"去共生"过程中的 bacteriocytes，并进行了关键代谢物的详细半定量估算（图4）。研究发现，随着甲烷供应的剥夺，具有共生菌特征拉曼带（约1643和1666 cm^-1）的马赛克结构和脂滴逐渐减少，bacteriocytes 的体积也因共生菌的丢失而减小。透射电镜结果证实共生菌逐渐被溶酶体消化，使细胞变小。

在原位 bacteriocytes 中，研究人员发现角鲨烯和羊毛固醇的信号在共生菌聚集的绿色和青色区域达到峰值，而胆固醇主要分布在核附近的脂滴中。基因组证据表明，贻贝宿主缺乏多个负责角鲨烯合成的酶，而这些酶可以由共生菌编码。同时，贻贝宿主在 bacteriocytes 内大量转录固醇相关基因，从共生菌获取营养。这些结果可能为宿主和共生菌之间代谢互作的关联提供了证据。

鳃细胞组分的半定量分析

通过统计分析经过内标归一化后的拉曼图像，研究人员对鳃细胞中的胆固醇、葡萄糖和色氨酸进行了半定量分析（图5）。发现胆固醇在去共生10周后含量增加，表明宿主可能消化共生菌并同化角鲨烯生成类固醇作为能源；葡萄糖含量在去共生10周后也增加，表明在没有甲烷供应的情况下，细胞先前储存的多糖（如糖原）可能被分解为葡萄糖用于能量生产，或者宿主消化共生菌可能导致多糖水解；色氨酸等氨基酸含量响应甲烷饥饿而增加，宿主可能主动合成它以满足生理需求。

本研究开发的CRM方法不仅为研究深海化能合成生态系统中宿主-共生菌代谢互作提供了新途径，还具有扩展到其他共生系统和多种生物的潜力。CRM在亚细胞分辨率上的半定量能力以及捕获代谢特征的可靠性已得到验证，表明它可以用于研究极端微生物的代谢分区、细胞或组织中的营养交换，甚至真核细胞器中动态代谢物运输。通过整合3D拉曼扫描和深度依赖信号校正，该方法可以进一步提高复杂组织或细胞内代谢物分布可视化的准确性，为生物学研究提供多功能工具。

研究的局限性在于，为了更精确地研究细胞内代谢机制，需要增加样本量以考察细胞间的差异和普遍性。由于拉曼信号强度有限，低浓度代谢物在当前平台上无法被检测到。未来，如何实现无需固定和提取的深海样本检测是一个需要解决的关键问题。

这项研究不仅揭示了深海贻贝与甲烷氧化菌之间复杂的代谢互作机制，更重要的是开发了一种强大的分析工具，为研究那些难以培养的微生物系统提供了新的技术路径，对理解宿主-微生物互作的基本生物学原理具有深远意义。