多重碱基编辑BCL11A调控元件治疗镰状细胞病：精准调控胎儿血红蛋白的新策略

本研究针对镰状细胞病（SCD）治疗中胎儿血红蛋白（HbF）诱导不足和双链断裂（DSBs）风险等问题，开发了多重碱基编辑技术同时靶向BCL11A的+58-kb和+55-kb增强子区域。通过精确破坏GATA1和ATF4结合位点，显著降低BCL11A表达并诱导高水平HbF，且避免了CRISPR-Cas9引起的基因组重排。该策略在长期重建的造血干细胞中展现出高效、安全且持久的治疗效果，为β-血红蛋白病的治疗提供了新方向。

　　

镰状细胞病（Sickle cell disease, SCD）是一种常见的遗传性贫血疾病，由于β-球蛋白（HBB）基因突变导致产生异常成人血红蛋白（HbS）。在低氧条件下，HbS会聚合并使红细胞镰状化，引发血管阻塞和多器官损伤。患者生活质量低下且寿命缩短。目前，异体造血干细胞移植虽可治愈SCD，但供体难寻，因此自体造血干细胞基因治疗成为重要方向。

胎儿血红蛋白（HbF）由γ-球蛋白（γ-globin）组成，具有抗镰状化作用，可竞争性减少HbS形成。研究表明，HbF水平升高能显著减轻SCD严重程度。BCL11A是HbF的关键抑制因子，其红细胞特异性增强子区域（如+58-kb和+55-kb）包含GATA1和ATF4等转录激活因子结合位点。此前，CRISPR-Cas9技术通过破坏+58-kb增强子中的GATA1结合位点下调BCL11A，已获批用于SCD和β-地中海贫血治疗，但存在HbF诱导水平不一、双链断裂（DSBs）导致基因组重排风险等问题。

为解决这些局限，Fontana等人在《Cell Reports Medicine》发表了最新研究，通过多重碱基编辑（Base editing）同时靶向BCL11A的+58-kb和+55-kb增强子，在不引起DSBs的情况下精确破坏关键DNA模体（motif），实现高效HbF诱导和表型挽救。

研究采用以下关键技术：1. 设计多种碱基编辑器（包括CBE、ABE和双功能TadDE）与sgRNA组合，靶向GATA1和ATF4结合位点；2. 使用SCD患者来源的造血干/祖细胞（HSPCs）进行体外编辑和分化；3. 通过深度测序（NGS、长读长测序、RNA-seq、全外显子测序）评估编辑效率、基因毒性及脱靶效应；4. 利用体外红细胞分化、集落形成实验（CFC）和镰状化分析评估功能挽救效果；5. 通过免疫缺陷NBSGW小鼠模型进行体内移植实验，评估长期重建造血干细胞中的编辑持久性和安全性。

Base editing disrupts the+58-kb and+55-kb BCL11A enhancers without affecting SCD HSPC viability and differentiation

研究人员首先设计了靶向+58-kb GATA1和+55-kb ATF4结合位点的多种sgRNA，结合胞嘧啶碱基编辑器（CBE）和腺嘌呤碱基编辑器（ABE），在SCD HSPCs中引入点突变。结果显示，碱基编辑效率高达56%-80%，且Indel频率显著低于Cas9处理组。CFC实验表明，编辑后细胞仍保持正常的克隆形成和分化潜能，证明碱基编辑不影响HSPCs活力。

HbF reactivation after base editing of BCL11A enhancers in SCD HSPCs

红细胞分化实验显示，+58 CBEI编辑（引入C>T突变）诱导的HbF水平接近Cas9编辑效果，而某些ABE编辑谱（如+58 ABEIII）虽效率较低但诱导能力较强。+55-kb编辑同样有效，且蛋白水平验证（HPLC和流式细胞术）证实HbF升高、HbS降低，镰状化细胞减少。

Dissecting GATA1 and ATF4 binding motifs to achieve robust HbF reactivation

通过单克隆分析，作者发现+58-kb区域中GATA1结合模体的特定碱基（如G3和A6）对HbF诱导至关重要。+55-kb区域中C7的突变对ATF4结合影响最大。这些发现明确了关键核苷酸位点，为优化编辑策略提供依据。

Enhanced γ-globin reactivation through multiplex editing

多重编辑（同时靶向+58和+55增强子）进一步提高了HbF水平，且双碱基编辑器（TadDE）效果最佳。值得注意的是，Cas9多重编辑虽有效但伴随较高缺失/倒位频率（33.1%），而碱基编辑组的基因组重排频率极低（<1.2%），安全性更优。

CBE- and DBE-mediated multiplex targeting of BCL11A efficiently rescues the sickling phenotype

选择CBE和DBE进行深入验证，发现其编辑效率相当，但DBE诱导的HbF水平更高（约28%），镰状细胞比例降至40%以下，与SCD杂合子携带者相当，表明表型挽救充分。

CBE- and DBE-mediated multiplex targeting of BCL11A: Genotoxicity assessment

全基因组脱靶分析（GUIDE-seq、WES）显示，碱基编辑的脱靶事件罕见且位于非编码区，未影响基因表达。RNA-seq证实无RNA脱氨现象。Cas9编辑则引发p53通路相关基因上调，提示DNA损伤反应。

Efficient multiplex base editing of BCL11A enhancers in repopulating hematopoietic stem cells (HSCs)

小鼠移植实验证明，编辑后的HSCs能长期重建多系造血，且编辑效率在体内维持稳定。人源红细胞中BCL11A下调、HbF升高，而B细胞中无影响，证实编辑的红系特异性。

该研究通过多重碱基编辑精准调控BCL11A增强子，实现了高效、安全的HbF诱导，为SCD治疗提供了优于现有CRISPR-Cas9策略的新方案。其避免DSBs的特性显著降低了基因组重排风险，且体内外实验证实了长期疗效和特异性。未来，大规模临床级生产和脱靶效应深度评估将推动该策略走向应用。