基于FFPE肿瘤样本的成像空间转录组技术平台比较研究揭示单细胞分辨率下的性能差异与临床应用潜力

本研究针对商业化成像空间转录组(ST)技术在肿瘤微环境研究中的性能评估需求，利用福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)的肺腺癌和胸膜间皮瘤组织微阵列样本，系统比较了CosMx、MERFISH和Xenium(单/多模态)平台的转录本检测效率、细胞分割准确性及表型注释可靠性。研究发现平台间存在显著的探针设计、背景噪音控制和组织年龄适应性差异，并建立了与批量RNA测序、GeoMx DSP和多色免疫荧光的正交验证流程，为精准空间生物学研究提供了关键技术选择依据。

　　

在肿瘤生物学研究领域，解析肿瘤微环境的空间结构犹如绘制一幅细胞社会的精密地图。传统的批量测序技术虽然能够提供基因表达的宏观视图，却无法揭示细胞在组织中的空间位置和邻里关系。随着空间转录组(Spatial Transcriptomics, ST)技术的崛起，科学家们终于能够同时获取基因表达信息和空间坐标，其中基于成像的方法更是实现了单细胞分辨率。然而，市场上多种商业化ST平台（包括CosMx、MERFISH和Xenium）的性能表现尚未在严格控制的实验条件下进行系统评估，这给研究人员选择合适的技术平台带来了巨大挑战。

为了解决这一问题，由Nejla Ozirmak Lermi和Max Molina Ayala共同领导的研究团队开展了一项综合性比较研究。他们采用2016-2022年间手术切除的肺腺癌和胸膜间皮瘤FFPE样本制作的组织微阵列(TMA)，系统评估了三大主流平台的性能表现。研究不仅关注技术参数如转录本计数和基因检测效率，还创新性地引入了病理学家手动表型评估，确保研究结果具有临床相关性。这项重要研究成果于2025年9月26日发表在《Nature Communications》期刊上。

研究团队运用了多种关键技术方法：包括FFPE样本制备与TMA构建、多平台ST检测（CosMx 1000-plex、MERFISH 500-plex、Xenium 289+50自定义基因panel）、批量RNA测序、GeoMx DSP全转录组分析、多重免疫荧光(mIF)染色，以及基于Seurat的生物信息学分析流程。样本队列来自MD安德森癌症中心的44例患者（22例肺腺癌，22例胸膜间皮瘤），涵盖了不同免疫特征（免疫热肿瘤与免疫冷肿瘤）和组织保存年限的样本。

实验设计与平台比较

研究设计包含四个TMA（ICON1、ICON2、MESO1、MESO2），分别进行不同平台的ST检测。基因panel比较显示三个平台仅共享93个基因，CosMx与Xenium共享154个基因，CosMx与MERFISH共享302个基因，Xenium与MERFISH共享118个基因。组织覆盖方面，CosMx因需要选择视野(FOV)而无法分析完整组织核心，而MERFISH和Xenium能够覆盖整个组织区域。

转录本与基因检测差异

转录本计数 per cell 显示CosMx在所有TMA中检测到最高的转录本数量和唯一表达基因数量(p<2.2e-16)。MERFISH在较老的ICON1和ICON2 TMA中检测到较低的转录本和基因数量，但在较新的MESO2 TMA中性能有所改善。Xenium-UM比Xenium-MM检测到更高的转录本和基因计数(p<2.2e-16)。

表达特异性与错误发现率

CosMx显示多个靶基因探针（如CD3D、CD40LG、FOXP3）的表达与阴性对照探针相似，在MESO2 TMA中高达31.9%的靶基因探针存在此问题。假发现率(FDR)分析显示CosMx在ICON TMA中的FDR为10-11%，在MESO TMA中为5.8-6.2%；MERFISH的FDR为4.4-6%；而Xenium平台的FDR均低于0.09%，表现出最佳的信号特异性。

细胞分割对细胞面积的影响

使用形态学标记指导的细胞分割算法（CosMx、MERFISH、Xenium-MM）比核扩张算法（Xenium-UM）表现更佳。Xenium-MM产生最小的平均细胞面积大小(p<2.2e-16)，最接近生物学真实细胞形态。Xenium-UM即使经过参数优化（75像素强度，7μm扩张距离），仍产生较大的细胞面积。

细胞检测与分割对表型分析的影响

细胞过滤后保留率差异显著：CosMx和Xenium平台保留了超过95%的检测细胞，而MERFISH在ICON1 TMA中损失了约75%的检测细胞。 disjoint基因对（如CD19-CD3E、EPCAM-CD3E）共表达分析显示，CosMx比其他平台显示更多细胞的共表达(p=0.057)，这可能与细胞分割错误有关。

与批量RNA-seq和DSP WTA的相关性

ST数据与批量RNA-seq的正相关性在所有数据集中均得到证实。在较老的ICON2 TMA中，CosMx(R=0.43)和MERFISH(R=0.39)与批量RNA-seq的一致性低于Xenium-MM；而在较新的MESO2 TMA中，CosMx(R=0.58)和MERFISH(R=0.64)的一致性显著提高。与GeoMx DSP WTA数据的相关性分析显示，CosMx数据(ICON2: R=0.84; MESO2: R=0.85)比MERFISH和Xenium平台有更好的相关性。

平台间基因检测一致性

CosMx和Xenium-UM数据(ICON2: R=0.86; MESO2: R=0.88)的相关性优于CosMx和MERFISH(ICON2: R=0.74)以及Xenium-UM和MERFISH(ICON2: R=0.67)。Xenium-UM和Xenium-MM在ICON2和MESO2组织块中表现出极强的相关性(R=0.99)，证明了即使使用不同的细胞分割方法，Xenium数据也具有高度可重复性。

细胞类型注释差异

在ICON2 TMA中，CosMx识别了9种主要细胞类型，但由于CD3E和CD19在所有细胞类型中的表达，无法区分B细胞和T细胞。MERFISH因基因表达低而难以清晰注释细胞类型。Xenium-UM成功检测到14种细胞类型，包括淋巴和静脉系统内皮细胞等亚型。Xenium-MM进一步检测到树突状细胞、T细胞亚群(CD4+和CD8+)和巨噬细胞（间质和肺泡）。

视觉评估细胞表型与分割

三位经验丰富的病理学家使用H&E和mIF染色切片作为金标准，对ST平台的细胞分割和表型注释性能进行评估。Xenium-MM在所有细胞类型中显示出最高的F1分数(中位数>75%)，与标准形态学评估结果高度一致。CosMx的F1分数范围最大，表明在某些情况下难以产生与形态学匹配的注释。MERFISH对所有细胞类型的F1分数最低。

研究结论与意义

这项系统性比较研究揭示了三大商业化成像ST平台在性能表现上的显著差异。研究发现，CosMx和MERFISH在新处理的TMA中表现更好，而Xenium在不同组织年龄间表现一致。平台间在panel大小、基因选择、探针设计策略等方面存在实质性差异，研究人员在设计实验前需要仔细调查panel设计是否覆盖其感兴趣基因。

研究表明，阴性对照和空白探针对于评估检测的背景信号至关重要。CosMx中阴性对照探针的高表达表明其背景噪声水平较高，而Xenium显示低阴性对照表达和低FDR值。缺乏阴性对照和空白探针会限制评估ST检测信号效率的能力。

准确的细胞分割一直是单细胞成像ST平台的难题。研究发现，使用形态学标记指导的细胞分割算法比细胞边界扩张方法表现更好，但这些算法依赖于形态学标记染色的质量。不准确的细胞分割会导致转录本被错误地分配给相邻细胞。

精确的细胞类型注释对于下游分析至关重要，并受到前述所有步骤的影响。研究表明，噪声水平高的平台（如CosMx）难以区分不同的细胞类型，而基因表达低的平台（如MERFISH）则难以清晰注释细胞类型。拥有匹配的scRNA-seq数据可通过Seurat共嵌入和标签转移来改进ST数据的注释。

病理学家对表型模式的组织学评估揭示了这些平台产生的大量数据中可能隐藏的问题。整合生物信息学与免疫和组织学分类的工作流程对于免疫肿瘤学研究至关重要。

该研究的局限性包括样本来自单一机构、缺乏更广泛肿瘤类型的包含、全组织切片分析，以及某些检测中缺乏阴性对照或空白探针。空间转录组学领域正在快速发展，多个商业公司发布了具有更多基因覆盖的ST检测面板（如CosMx 6K、Xenium 5K）。

总之，这项研究为选择适合的单细胞成像ST检测提供了关键的技术选择依据，建立了评估ST数据质量的多参数框架，并强调了整合生物信息学与病理学评估在空间生物学研究中的重要性。随着技术的不断进步和标准化程度的提高，空间转录组学有望为我们理解肿瘤微环境和开发新的治疗策略提供更加强大的工具。