工程化毒素与Cas6-CBS系统构建超紧凑转录本降解器STAR实现高效低脱靶RNA敲低

本研究针对现有RNA敲低技术（如RNAi和CRISPR-Cas系统）存在的尺寸过大、脱靶效应高及无法靶向核内转录本等问题，通过挖掘并改造三种小型毒素内切核糖核酸酶（barnase、MqsR和MaZF），结合大肠杆菌来源的催化失活Cas6（dEcCas6）及其识别茎环RNA（CBS），开发出超紧凑转录本降解系统STAR（317-430个氨基酸）。该系统在哺乳动物细胞中实现了胞质mRNA和核内非编码RNA的高效降解，且脱靶活性显著低于CRISPR和RNAi技术。其小尺寸特性支持单次AAV递送进行多重RNA敲低，成功沉默人癌细胞中致癌RNA MYC，为RNA水平基因调控提供了新型微型化工具。

　　

在基因表达调控领域，RNA水平的干预因其可逆性、低基因组永久改变风险和更广泛的靶向可及性而备受关注。目前广泛使用的RNA干扰（RNAi）技术，特别是利用天然细胞过程的小干扰RNA（siRNAs），在分子生物学和治疗应用中存在明显局限：无法在原核生物、真核细胞核或缺乏RNAi机制的胞质区室中应用，且存在可控性差和脱靶效应等问题。虽然CRISPR-Cas系统（如I型III类CRISPR-Csm复合物、单蛋白III型Cas7-11和VI型Cas13家族）作为可编程RNA降解工具显示出改进的特异性和扩展的靶向能力，但这些系统及其必需表达模块通常接近或超过常用递送载体（如腺相关病毒AAV）的包装极限（约4.7 kb），严重限制了其治疗应用。

为解决尺寸限制，研究者尝试缩小CRISPR工具包，如发现天然小Cas酶（Cas13X.1和Cas13bt1）或通过AlphaFold预测指导结构工程创建迷你版RfxCas13d，但过程复杂繁琐且功能保持有限。融合小RNA结合蛋白与核糖核酸酶人工构建超紧凑RNA降解系统成为新方向，例如模块化CRISPR启发RNA靶向系统（CIRTS，432个氨基酸）通过融合缩小版发夹结合蛋白U1A（TBP6.7）与非特异性核糖核酸酶Pin结构域（SMG6）实现直接转录本降解，但效率较低（平均40-50%），且依赖锰离子（Mn2?）催化活性和额外非特异性单链RNA结合蛋白（ORF5）稳定引导RNA，增加了复杂性和尺寸。

原核毒素作为一类微小核糖核酸酶，根据其对应抗毒素性质分为八个亚组。II型核糖体非依赖性毒素能以序列特异性方式高效消化RNA且无需辅助组件，但其切割基序短于四个核苷酸（常见于细胞RNA中）的特性可能引发脱靶效应和细胞毒性。同时，使用比TBP6.7及其发夹RNA（纳摩尔级亲和力）更高亲和力的小RNA结合蛋白可延长融合核糖核酸酶在RNA底物上的停留时间，提升切割效率。Cas6（约200个氨基酸）作为I-E型CRISPR复合体核心组件，与其同源茎环RNA（CBS，20-30核苷酸）具有皮摩尔级超高亲和力，且具备内切核糖核酸酶活性，能在CBS的3'区域特定位点切割。虽然利用Cas6的核酸酶特性通过插入CBS到靶基因位点可实现RNA降解，但该方法增加操作复杂性并可能干扰正常RNA功能甚至导致意外降解。

该研究通过理性设计改造毒素为更特异安全的核糖核酸酶，并将其与大肠杆菌来源的核酸酶失活Cas6-CBS系统整合，开发出超紧凑RNA降解系统STAR（基于小毒素和dEcCas6-CBS的RNA降解器）。通过工程化barnase、MqsR和MaZF毒素，生成一系列dEcCas6-毒素变体，利用快速双荧光报告系统和哺乳动物细胞毒性试验筛选出八个具有最佳核糖核酸酶活性和最小细胞毒性的变体。研究团队精细解析了CBS序列特征对EcCas6切割及稳定EcCas6/dEcCas6结合的关键作用，设计了可有效招募dEcCas6-毒素的CBS引导系统。研究发现三种毒素变体对ORF5元件表现出不同依赖性，其中ORF5-dEcCas6-barnase 11（430氨基酸）、dEcCas6-MqsR 20（317氨基酸）和dEcCas6-MaZF 28（330氨基酸）对胞质mRNA的敲低效率与RfxCas13d和短发夹RNA（shRNA）方法相当，并能有效降解核内非编码RNA（ncRNAs）。RNA测序显示dEcCas6-MaZF 28脱靶效应最小，优于RfxCas13d和shRNA方法。最终，AAV包装的STAR成功实现内源转录本的多重敲低和人肝癌细胞系HepG2中致癌RNA MYC的有效降解，展示了其治疗应用潜力。

研究采用的主要技术方法包括：蛋白质理性设计与定向进化（对barnase、MqsR和MaZF毒素进行关键位点突变）；双荧光报告系统筛选（监测脱靶和靶向活性）；流式细胞术检测荧光强度；细胞毒性试验（CCK-8法）；CRISPR激活（CRISPRa）系统评估结合亲和力；RNA测序分析脱靶效应；qPCR定量转录本水平；Western blotting检测蛋白表达；AAV载体构建与包装（使用AAV-DJ血清型）；细胞凋亡检测（Annexin V-FITC/PI染色）。

Diminishing the RNA cleavage activity of dEcCas6-toxins through protein engineering

通过系统突变barnase、MqsR和MaZF毒素的催化位点和底物结合残基，构建了数十个变体，利用双荧光报告系统（BFP监测脱靶，GFP监测靶向降解）在HEK293T细胞中筛选出八个高活性低毒性变体。其中barnase 11（N58D/R59A/E73A/H102A）显示最低脱靶效应和高效靶向降解，MqsR 20（Y60A/K97A）和MaZF 28（S54A/K55A/G56A/Y57A）也表现出最优性能。连接肽（GGS）3和HA标签对比发现不同连接器显著影响活性水平。

Characterization of CBS features for EcCas6 cleavage

将29nt野生型CBS（wtCBS）划分为茎（6bp）、环（4nt）、5'侧翼（5nt）和3'侧翼（8nt）四个区域，构建系列工程化CBS（enCBS）变体并整合到GFP mRNA的5'UTR创建GFP-OFF报告系统。发现茎区截短（1-2bp）保持活性，3bp截短完全失活；茎区延伸（随机或C-G配对）维持活性；环区大小在0-50nt间具有高度适应性，但4bp茎无法支持大于20nt的环；5'和3'侧翼序列单点突变影响小，完全改变3'侧翼仅轻微降低活性。

Characterization of CBS features for EcCas6 and dEcCas6 binding

设计CRISPRa系统（dSpyCas9/sgRNA-enCBS + EcCas6/dEcCas6-VPR + miniCMV-GFP）评估结合亲和力。七个可切割CBS变体显示不同结合能力：m22-29和d22-29（3'侧翼缺失）亲和力类似wtCBS，loop10降低，m1-5、t-2和t+4CG显著降低。dEcCas6结合要求比EcCas6切割更严格，稳定结合需要更保守序列特征。

Design of guide CBS in STAR

采用二价引导CBS（bgCBS）设计，将两个wtCBS与靶向NRAS转录本的间隔序列组合。发现ORF5融合对barnase至关重要（提升效率32%），通过保护间隔序列避免降解；间隔序列长度40-50nt最优；单价gCBS（mgCBS）效率低于二价；高亲和力enCBS(d22-29)位置影响效率（3'端放置恢复活性）。最佳转染条件为200ng ORF5-dEcCas6-barnase 11质粒+400ng bgCBS质粒。

Endogenous RNA degradation by STAR

三种高效降解器（ORF5-dEcCas6-barnase 11、dEcCas6-MqsR 20和dEcCas6-MaZF 28）对胞质mRNAs（NRAS、PPIB、NFKB1、KRAS、SMAD4、MYC）的敲低效率达61-94%，优于或匹配RfxCas13d和shRNA；对核内ncRNAs（XIST、NEAT1）也有效（49-85%），克服RNAi核内无效限制。RNA测序显示dEcCas6-MaZF 28脱靶基因最少（<100个），RfxCas13d和shRNA则数百个基因差异表达。

Multiplex RNA knockdown activity of STAR via AAV delivery

质粒递送可实现双重（83-87%）和三重（68-75%）基因敲低，特异性高。AAV-DJ包装的STAR（含CMV启动的dEcCas6-MaZF 28和U6启动的bgCBS）在MOI 1×10? vgs/cell时最优，对单转录本敲低效率达75-95%，多重敲低效率略有下降。在HepG2细胞中靶向致癌MYC mRNA，降低mRNA78%和蛋白53%，抑制细胞增殖并诱导23%凋亡。

研究结论表明STAR成功将工程化毒素与dEcCas6-CBS系统整合，创建出超紧凑（317-430氨基酸）、高效（敲低效率56-94%）且低脱靶的人工转录本降解器，其小尺寸支持单AAV递送多重调控能力，并能靶向传统RNAi无法作用的核内转录本。通过理性设计减弱毒素活性同时保持靶向效能，解析CBS特征指导引导设计，发现不同毒素对保护蛋白ORF5的依赖性差异，为简化系统提供方向。相比CRISPR-Cas系统（如Cas13家族>690氨基酸），STAR在尺寸、特异性和应用范围上具有显著优势，为基因治疗和基础研究提供了新型可编程RNA操控工具。