利用吲哚支架开发新型IRE1α变构抑制剂调控XBP1 mRNA剪接以治疗内质网应激相关疾病

本研究针对IRE1α-XBP1通路在内质网应激反应中的关键作用，开发了一种基于吲哚支架的高效选择性IRE1α抑制剂IA107。通过结构优化和机制研究，发现IA107通过结合激酶结构域变构抑制RNase活性，且不影响二聚化。该研究为治疗癌症、神经退行性疾病等内质网应激相关疾病提供了新型先导化合物。

　　

在细胞的生命活动中，内质网扮演着蛋白质合成、折叠和修饰的重要角色。当错误折叠的蛋白质在内质网中累积时，就会引发内质网应激（ER stress），此时细胞会启动未折叠蛋白反应（UPR）来恢复稳态。其中，IRE1α（inositol-requiring enzyme 1 alpha）作为最保守的内质网应激传感器，具有激酶和核糖核酸酶（RNase）双重功能，通过剪切XBP1 mRNA产生转录因子XBP1s，调控下游应激应答基因表达。然而，IRE1α信号通路的异常活化与多种人类疾病密切相关，包括癌症、神经退行性疾病、代谢性疾病等，因此针对IRE1α的小分子抑制剂具有重要的治疗潜力。

尽管已有一些IRE1α抑制剂被报道，如靶向激酶ATP结合口袋的KIRA8、AMG-18等，以及直接作用于RNase催化中心的羟基芳醛类化合物，但这些抑制剂在化学结构、作用机制及选择性方面仍存在一定局限性。开发具有新颖化学骨架和独特作用机制的IRE1α抑制剂，不仅有助于拓展靶向IRE1α的治疗选择，也对深入理解UPR信号网络的调控机制具有重要意义。

在这项发表于《Nature Communications》的研究中，研究人员通过高通量筛选发现了一类基于吲哚骨架的IRE1α抑制剂，并对其进行了系统的结构优化、生化验证及机制探讨。他们最终获得了高效、高选择性的先导化合物IA107，解析了其与磷酸化IRE1α的复合物晶体结构，阐明了一种新的变构抑制机制，并在细胞水平验证了其对XBP1剪接的抑制活性。

本研究主要采用了以下关键技术方法：基于荧光共振能量转移（FRET）的高通量筛选；差示扫描荧光法（DSF）和等温滴定量热法（ITC）验证结合；微尺度热泳（MST）测定亲和力；分子对接与共晶结构解析（PDB: 9GOW）；激酶选择性谱分析；RNA剪接检测（RT-qPCR和Western blot）；细胞热转移分析（CETSA）验证靶点结合；以及利用酯类前药策略改善细胞活性。

Identification and characterization of the IRE1α hit IA01

通过FRET筛选体系，研究人员从约1万个化合物中发现了初步命中化合物IA01，该化合物对未磷酸化和磷酸化IRE1α均表现出抑制活性（IC₅₀分别为0.30 μM和0.32 μM）。凝胶电泳切割实验、DSF和ITC结果进一步证实了IA01与IRE1α的直接结合。

Structural modifications yielding potent IRE1α inhibitor IA107

通过对吲哚C-3位、N-取代位和C-5位的结构修饰，研究团队系统分析了构效关系。结果表明，C-3位的丙酸基团对维持活性至关重要；N-苯甲酰基取代可显著提升活性；C-5位引入溴原子得到IA107，其对IRE1α和p-IRE1α的IC₅₀分别达到16 nM和9 nM，成为该系列中活性最强的化合物。

Biochemical and biophysical characterization of IA107 and the binding mechanism studies

IA107在凝胶切割实验和DSF中均表现出浓度依赖的抑制和稳定作用。MST测定显示其与p-IRE1α的亲和力更高（K_D = 152 nM）。酶动力学分析表明IA107以非竞争性方式抑制XBP1 mRNA底物。进一步竞争性ITC和激酶抑制实验显示，IA107与已知激酶结构域配体G1749竞争结合IRE1α，说明其作用位点为激酶区的ATP结合口袋。

IA107 binding mode study via co-crystal structure

IA107与p-IRE1α的复合物晶体结构（分辨率2.3 ?，PDB 9GOW）显示，IA107结合于激酶结构域的ATP口袋，其丙酸基团与DFG基序中的D711和催化残基K599形成关键氢键，苯甲酰基羰基与C645骨架形成氢键。与apo结构相比，IA107的结合引起激酶结构域αC螺旋轻微位移，但盐桥K599–E612保持完整，DFG motif构象未发生显著改变。重要的是，IA107结合后并不破坏激酶结构域二聚化，但导致RNase结构域二聚体界面分离，关键催化残基H910和D847之间的相互作用被破坏，从而变构抑制RNase活性。

IA107 is selective against IRE1α over other kinases

激酶谱分析结果表明，IA107在5 μM浓度下对大多数激酶无明显抑制，仅对IRE1β（ERN2）有较弱抑制（IC₅₀ = 1440 nM），表现出良好的选择性。

IA107 inhibited ER stress and induced XBP1 mRNA splicing

在A549细胞中，IA107可浓度依赖性地抑制衣霉素（tunicamycin）诱导的XBP1 mRNA剪接。为提高细胞膜通透性，研究团队设计并合成了酯类前药IAPD1。该前药在细胞内可转化为活性形式，显著抑制XBP1剪接（IC₅₀ = 180 nM），并在Western blot中降低XBP1s蛋白水平。CETSA结果显示IAPD1能稳定细胞内的IRE1α，进一步证实了靶点结合。抗增殖实验表明IA107和IAPD1均无明显细胞毒性。

本研究成功开发了一类基于吲哚结构的高效、高选择性IRE1α抑制剂，其中先导化合物IA107通过结合IRE1α激酶结构域变构抑制其RNase活性，且不干扰蛋白二聚化。该抑制作用通过破坏RNase结构域二聚界面及关键催化残基间的相互作用而实现。此外，酯前药IAPD1显著改善细胞活性，有效抑制内质网应激诱导的XBP1剪接。该研究不仅为治疗UPR相关疾病提供了新的候选化合物，也深化了对IRE1α调控机制的理解，拓展了靶向IRE1α小分子在生物学应用中的潜力。