ATP酶关联逆转录酶的结构基础揭示抗噬菌体防御新机制——逆转录合成染色体外DNA支架激活SMC ATP酶组装

研究团队针对细菌如何利用逆转录酶（RT）进行抗噬菌体防御这一科学问题，开展了I-A型retron系统的结构与功能研究。通过冷冻电镜技术解析了364 kDa复合物的三维结构，发现噬菌体核酸酶降解msDNA后可激活HNH核酸酶切割tRNASer，从而抑制翻译并阻断病毒复制。该研究揭示了逆转录酶在遗传寄生虫清除中的新功能，为抗病毒机制研究提供了新范式。

　　

在微生物与噬菌体持续数十亿年的进化军备竞赛中，细菌不断演化出精妙的免疫机制来抵御病毒入侵。逆转录酶（Reverse Transcriptase, RT）长期以来被认为主要参与逆转录病毒和逆转录转座子的复制传播，但近年研究发现原核生物也利用RT参与抗病毒防御。其中I-A型retron系统作为细菌免疫系统的重要成员，其由逆转录酶、非编码RNA（ncRNA）、多拷贝单链DNA（msDNA）、结构维持染色体（SMC）家族ATP酶和HNH核酸酶组成，然而这些组件如何组装成功能复合物以及其抗病毒机制始终是未解之谜。

发表在《Nature Communications》的研究通过综合运用结构生物学、生物化学和遗传学方法，揭示了I-A型retron系统的组装机制和抗病毒原理。研究人员主要采用冷冻电镜（cryo-EM）技术解析复合物结构，结合AlphaFold3结构预测、噬菌体挑战实验、 tRNA测序（MSR-seq）和荧光显微镜成像等技术，系统阐明了该防御系统的工作机制。

研究结果

I-A型retron系统保护细菌抵御噬菌体

通过将大肠杆菌FORC82菌株的retron操纵子克隆至MG1655菌株，研究发现该系统对T3和T5噬菌体具有显著防御作用，而对T4和T7无效。ATP酶（D387A）和HNH核酸酶（H71A）的活性位点突变会完全消除防御能力，而RT活性位点突变（YADD至YAAA）无法成功克隆，表明这些突变具有细胞毒性。

逆转录酶合成的染色体外DNA作为SMC ATP酶的支架

通过比较AlphaFold3预测的ncRNA-RT复合物结构与实验确定的retron结构，发现逆转录过程中ncRNA的3'端通过活性位点 reel进入由拇指和掌域形成的裂隙，而SL-1分子手柄始终与RT结合。clamp（CL）序列作为关键连接点，同时接触cDNA的3'端、ATP酶和RT的关键结构域。

ATP酶同源二聚体与msDNA形成广泛的静电相互作用网络。IS1柔性环含有多个碱性残基与msDNA结合，而IS2 coiled-coil结构域形成特征性 bear hug和dorsal fin结构环绕msDNA。结构引导的突变实验表明，破坏RT与ATP酶界面（S217R, N219R, E220R）或IS1多重电荷交换突变（R195E, K196E等）均导致系统无法克隆，证实msDNA和RT在ATP酶组装中的核心作用。

ATP酶同源二聚体形成钳状结构抓取HNH核酸酶

HNH核酸酶通过ATP酶C端延伸形成的 triple helix结构锚定在retron复合物上。相邻亚基的C端 triple helix形成钳状结构抓取HNH核酸酶的C端区域，ATP酶突变（D522R, L523R等）导致完全丧失防御能力。HNH以不对称方式被招募到复合物的一侧，呈现 up或down两种取向。

msDNA作为噬菌体传感器

通过筛选T3噬菌体逃逸突变体，发现丝氨酸/苏氨酸激酶、核酸外切酶、尾部蛋白和尾纤维蛋白等多个基因发生突变。共表达核酸外切酶与retron导致严重生长缺陷，而核酸外切酶活性位点突变（D162K）或逃逸突变（W48R）则无此现象。实验证实T3、T5和T7核酸外切酶能触发msDNA降解，但T4核酸外切酶无此功能。

Retron激活触发翻译抑制

与降解病毒DNA的Septu系统不同，retron系统激活后未观察到DNA降解，而是出现核质压缩和碘化丙啶排斥现象。tRNA测序分析显示，在WT retron和T3核酸外切酶共表达的细胞中，大肠杆菌的四种丝氨酸tRNA均显著减少。AlphaFold3低置信度模型提示HNH可能通过二聚化发挥功能。

研究结论与意义

该研究通过解析I-A型retron系统的三维结构，揭示了逆转录酶合成染色体外DNA作为结构支架招募SMC ATP酶和HNH核酸酶组装成364 kDa抗病毒复合物的机制。当噬菌体感染时，其编码的核酸外切酶降解msDNA，可能触发复合物解离并激活HNH核酸酶，进而特异性切割细胞tRNA^Ser，抑制蛋白质合成并阻断病毒复制。

这一发现具有多重重要意义：首先，阐明了逆转录酶在抗病毒防御中的新功能，颠覆了其仅参与自私遗传元件复制的传统认知；其次，揭示了SMC ATP酶在DNA修复和免疫系统中的功能可塑性；第三，发现了HNH核酸酶家族中罕见地以tRNA为底物的新成员；最后，为理解细菌与噬菌体之间的分子军备竞赛提供了新视角，表明tRNA的进化可能受到免疫系统与病毒冲突的选择压力。

该研究不仅深化了对原核生物抗病毒机制的理解，也为开发基于retron的新型基因编辑工具和抗菌策略提供了理论基础。研究显示的msDNA作为分子传感器的作用机制，可能为设计人工免疫系统提供新的分子设计思路。