胰腺癌中损伤相关小叶微生态位塑造经典肿瘤表型的新机制

本研究针对胰腺导管腺癌（PDAC）侵袭模式的认知空白，通过多组学与机器学习方法，揭示了肿瘤细胞定植于损伤胰腺小叶的微环境新路径。团队发现小叶侵袭前沿的肿瘤细胞与经历损伤诱导变化的腺泡细胞及NGFR+/PDGFRα+成纤维细胞密切关联，该微生态显著促进经典表型（classical）分化，而纤维化区域则偏向基底样表型（basal）。这一空间表型异质性机制为PDAC靶向治疗提供了新型微环境干预策略。

　　

胰腺导管腺癌（PDAC）是最具侵袭性的实体肿瘤之一，其典型的组织学特征为肿瘤细胞巢被致密的纤维间质所包裹。这种促结缔组织增生性微环境长期以来被认为是肿瘤细胞诱导基质细胞增殖和细胞外基质沉积的结果。然而，在PDAC进展过程中，肿瘤细胞与周围胰腺组织相互作用的时空动态仍不明确。尤其值得注意的是，癌旁胰腺组织常存在慢性胰腺炎和反应性上皮变化，这使得准确识别肿瘤边界区域变得复杂。

传统观点认为，胰腺上皮细胞的致癌转化先于间质活化数天至数周，但关于已形成的PDAC中癌细胞持续侵袭的空间序列仍知之甚少。与可清晰界定侵袭边界的肝转移瘤不同，PDAC的生长更为弥散，且常伴有癌旁胰腺的再生和炎症变化，这给精确识别肿瘤细胞带来了挑战。

在这项发表于《Nature Communications》的研究中，Sara Soderqvist等研究人员通过多模式、跨物种的分析方法，结合人类切除标本和小鼠模型，揭示了PDAC定植和侵袭胰腺小叶的新路径。他们发现，在浸润的小叶中，腺泡损伤和非促结缔组织增生性间质活化区域定义了肿瘤的侵袭边缘。

研究团队运用机器学习辅助的图像分析结合多重蛋白谱分析，发现人类PDAC细胞与经历腺泡-导管化生（ADM）的特定非恶性上皮细胞亚群共定位，这是一种与损伤相关的再生程序。该微环境与经典肿瘤表型密切相关，而促结缔组织增生区域则更多地与基底表型相关。进一步通过原位注射近克隆肿瘤细胞的小鼠实验显示，在小叶侵袭区域，肿瘤表型从基底型向经典型切换，表明胰腺小叶微环境对PDAC表型具有调控作用。

为开展本研究，作者主要采用了以下关键技术方法：

1. 1.
   基于卷积神经网络的机器学习算法对临床样本进行组织类型注释
2. 2.
   多重免疫组化（IHC）和免疫荧光（m-IF）进行空间蛋白谱分析
3. 3.
   单细胞RNA测序（scRNA-seq）分析小鼠和人类PDAC数据集
4. 4.
   正交原位注射小鼠模型研究克隆性肿瘤生长
5. 5.
   人PDAC手术标本队列分析（n=108）
6. 6.
   腺泡细胞与肿瘤细胞体外共培养系统

研究结果方面：

胰腺小叶定植定义PDAC侵袭的新路径

通过对108例PDAC患者的组织学切片回顾，研究发现95.4%的肿瘤存在小叶侵袭。利用p53和SMAD4免疫组化准确识别肿瘤细胞，发现小叶内肿瘤细胞比例范围为4%-32%（平均14.8%）。这表明除了经典的间质定位外，胰腺小叶是PDAC侵袭的普遍部位。

经典PDAC细胞亚型在小叶微环境中占主导

研究人员使用包含2个经典标志物（CDX2、MUC5AC）和4个基底标志物（KRT5、HMGA2、CA125/MUC16、KRT17）的面板，对31例患者的肿瘤细胞表型进行空间分析。发现与间质区域相比，小叶内的肿瘤细胞基底标志物（CA125、KRT17、HMGA2）阳性细胞分数显著降低，而经典标志物（MUC5AC、CDX2）阳性分数更高。无监督层次聚类分析将小叶来源的感兴趣区域与间质来源的区域分开，表明微环境位置与肿瘤表型密切相关。

机器学习辅助的组织分析揭示肿瘤细胞定位于慢性胰腺炎样小叶微环境

研究人员训练卷积神经网络识别IHC全切片图像中的主要组织类型，使用NGFR和CD146区分间质和上皮结构。通过对9326个区域的分析发现，小叶内的肿瘤细胞虽然也常与"纤维化"类别相邻，但相比间质区域（97%）频率较低（80.5%）。更重要的是，小叶内肿瘤细胞主要与ADM细胞相邻，而间质中的肿瘤细胞则更常靠近神经和血管，这与PDAC典型的神经周围和血管侵袭模式一致。

随着小叶萎缩程度的增加，早期/中期ADM（KRT19和AMY双阳性细胞）在最严重萎缩状态中显著富集，而腺泡细胞（AMY⁺/KRT19^-）丰度随着萎缩程度增加而下降。

损伤相关的NGFR⁺成纤维细胞群体定位于小叶肿瘤侵袭前沿

空间映射显示，在小叶肿瘤侵袭中，PDAC细胞与纤维化的并列在小叶外围富集，而肿瘤细胞/ADM和肿瘤细胞/腺泡接触在肿瘤-外分泌细胞边界的侵袭前沿达到峰值。

NGFR在良性纤维化病变中上调，与胰腺炎相关的间质表达有关。分析小鼠急性实验性胰腺炎的scRNA-seq数据发现，急性胰腺损伤期间NGFR⁺间质细胞富集。NGFR表达与iCAF标志物PDGFRα重叠，但不与apCAF标志物CD74和myCAF标志物ASMA（由ACTA2编码）重叠。

在人类PDAC中，NGFR丰度随着肿瘤细胞与小叶内肿瘤-外分泌界面距离的增加而降低。形态未受影响的小叶中NGFR表达基线较低，而表现出癌周慢性胰腺炎但无肿瘤侵袭的小叶中NGFR表达最高。伴有肿瘤侵袭的晚期萎缩小叶中NGFR表达急剧下降。

NGFR⁺小叶成纤维细胞与已知CAF亚型部分重叠

通过多重免疫荧光（m-IF）分析ASMA、PDGFRα、CD74、Vimentin和p53，发现ASMA⁺细胞在肿瘤细胞巢最内层间质层中富集，而PDGFRα⁺细胞在任何层中均未富集，CD74⁺细胞在肿瘤间质区域的最内层富集。值得注意的是，肿瘤间质区域始终缺乏NGFR。

在小叶有肿瘤侵袭的区域，NGFR⁺间质细胞高度共表达iCAF标志物PDGFRα（94%），而22%的NGFR⁺细胞ASMA阳性，34%CD74阳性。相比之下，围绕肿瘤间质的PDGFRα⁺细胞大多NGFR阴性。

分析小鼠原位PDAC注射模型和两个人PDAC研究的scRNA-seq数据，发现所有三个数据集中都存在NGFR⁺间质细胞，其中大多数共表达一个或多个CAF标志物（ACTA2、CD74、PDGFRα）。PDGFRα在所有数据集中与NGFR表达重叠最强。

基因本体（GO）分析显示，小鼠和人类NGFR⁺细胞均富集免疫调节功能。小鼠NGFR⁺细胞主要表现出与记忆T细胞活化和抗原呈递相关的基因特征，而人类NGFR⁺细胞则显示出更广泛的免疫调节功能富集。

在时间序列分析中，NGFR特征和iCAF特征在注射后早期时间点（第10天）富集。在肿瘤细胞水平，经典特征在注射后早期占主导，而后期时间点则富集与小鼠PDAC侵袭性疾病相关的基底和间质特征。在人类PDAC数据集中，表达NGFR特征的间质细胞在较小的T1肿瘤中更丰富，T1肿瘤显示出先前描述的与良好预后相关的"正常间质特征"的富集。

克隆性小鼠胰腺癌中的区室驱动表型转换

为了评估肿瘤细胞表型与其定位于小叶还是间质区室的关联，研究人员使用了小鼠PDAC模型。在Kras^G12D/+;Pdx1-Cre（KC）小鼠的癌前病变中，HMGA2蛋白表达有限，而在KPC小鼠的侵袭性肿瘤中显著更高。GAL4在PanIN病变中检测到，但在正常导管细胞中很少表达。

通过将带有tdTomato等位基因的KPCT细胞正交原位注射到免疫活性C57BL/6J小鼠中，研究发现正交PDAC细胞注射与巨大的克隆选择相关。在三只小鼠中，两个克隆占肿瘤细胞的90%以上，其中两只小鼠的肿瘤是单克隆的。

H&E染色显示，正交模型中的肿瘤表现出更高的基底PDAC表型标志物表达，与自体模型相比，可能由于允许脱膜发生发展的时间有限（三周对比约三个月）。肿瘤细胞相邻的ADM在形态上明显。

通过免疫荧光定量基底肿瘤标志物HMGA2和经典标志物GAL4，并使用腺泡标志物AMY确认小叶侵袭区域，发现与人类PDAC一致，位于小叶内的肿瘤细胞HMGA2表达水平低于间质区域，而GAL4表达在小叶区域更高。这导致经典样肿瘤细胞在小叶区室中显著富集，基底样肿瘤细胞在富含间质的区域富集。

体外共培养实验显示，远离腺泡细胞的肿瘤细胞HMGA2表达显著更高，而靠近腺泡细胞巢的肿瘤细胞GATA6表达升高，尽管效应大小有限。这些发现支持腺泡/ADM细胞与肿瘤细胞的相邻性促进但不完全诱导相邻PDAC细胞从基底向经典样表型转变的模型。

讨论与意义

本研究证明了肿瘤定植胰腺小叶是PDAC侵袭的重要路径，并确定了在浸润小叶内独特的微环境，以ADM和NGFR⁺/PDGFRα⁺炎症相关间质细胞为特征。该小叶生态位影响肿瘤细胞表型，导致肿瘤微环境内的空间异质性。

研究结果表明，PDAC侵袭损伤小叶伴随着短暂的、损伤相关的微环境，包括ADM和NGFR⁺/PDGFRα⁺间质细胞。这种小叶微生态位可能在早期侵袭期间有助于塑造肿瘤细胞表型，然后在完全促结缔组织增生间质建立之前。更好地理解这种上皮丰富、损伤相关的区室可能对早期PDAC检测和干预具有重要意义。

特别值得注意的是，识别小叶定植的细胞特征，如ADM和短暂的NGFR⁺间质，可能为在促结缔组织增生完全建立之前识别肿瘤的诊断策略提供信息。虽然本研究强调小叶侵袭是PDAC中一个先前未被充分认识的生长模式，但这种生态位对疾病进展和预后的整体贡献仍有待充分确定。

此外，研究揭示了肿瘤-上皮细胞相互作用的重要性，这与广泛研究的肿瘤-间质和肿瘤-免疫相互作用形成对比。来自肺癌中肿瘤-肺泡细胞相互作用和肝癌中肿瘤-肝细胞串扰的新兴观察结果，以及本研究的结果，支持上皮丰富区室内的相互作用可能有助于塑造肿瘤细胞行为，并可能以组织上下文依赖的方式影响治疗反应的观点。

综上所述，这项研究不仅揭示了PDAC侵袭的新路径，还为理解肿瘤微环境如何塑造肿瘤细胞表型提供了重要见解，为未来开发针对特定微环境区室的治疗策略奠定了理论基础。