优化EMS诱变浓度构建高粱大型突变体库以支持FIND-IT技术应用

《Discover Agriculture》：Fine-tuning EMS treatments to produce large sorghum mutant populations for FIND-IT

本刊推荐：为构建适用于FIND-IT（Fast Identification of Nucleotide variants by droplet digital PCR）技术的大型高粱突变体库，研究人员系统优化了EMS（ethyl methanesulfonate）诱变浓度（0.05%、0.15%、0.25%），结合田间农艺性状观测与全基因组测序分析，发现0.10% EMS浓度可在保证种子产量与发芽率的同时，诱导足够数量的编码区突变（平均133个错义突变/株），为高粱功能基因组学与育种研究提供了关键资源。

　　

作为全球重要的谷类作物，高粱（Sorghum bicolor）以其卓越的抗逆性和多用途特性闻名，不仅是重要的粮食来源，还被广泛应用于饲料、生物燃料、酿造原料及环境修复等领域。尤其在高光照、高温和干旱等恶劣环境下，高粱凭借其C₄光合途径展现出显著优势，使其成为边际土地利用中的理想作物。然而，与水稻、小麦和玉米等主要谷物相比，高粱的平均产量仍相对较低，且受基因型、管理措施和环境条件的影响较大。因此，通过现代育种技术开发具有更高产量、更强抗逆性和更优终端用途性状的高粱品种，已成为研究热点。

在此背景下，利用化学诱变剂如甲基磺酸乙酯（EMS）创制突变体库，成为发掘新等位基因变异和解析基因功能的重要手段。EMS作为一种烷化剂，可特异性诱导鸟嘌呤（G）烷基化，进而导致G/C至A/T的碱基转换，从而在基因组中随机引入点突变。通过研究这些突变体，不仅能够揭示基因功能，还可为育种提供新种质。然而，构建大规模突变体库面临两大挑战：一是需要达到基因组突变饱和（即覆盖所有可能的G和C碱基），二是要保证足够的种子产量和植株存活率以用于下游筛选。

传统的反向遗传学技术如TILLING（Targeting Induced Local Lesions in Genomes）因其灵敏度限制，难以应对大规模群体的筛选。而基于全基因组测序（WGS）的方法虽然精准，但成本高昂。近年来发展的FIND-IT（Fast Identification of Nucleotide variants by droplet digital PCR）技术，通过微滴数字PCR（ddPCR）实现了对数十万至数百万个体的大规模、高通量筛选，显著提高了突变体筛选效率。为充分发挥FIND-IT技术的潜力，优化EMS诱变条件以平衡突变密度与植株农艺性状显得至关重要。

虽然此前已有研究利用EMS构建了高粱突变体库，但多数群体规模较小（通常<10,000株），且缺乏针对大规模群体构建的EMS浓度系统优化研究。特别是如何在不同EMS浓度下，权衡突变负荷、种子产量、发芽率等关键参数，尚未有明确结论。因此，本研究以高粱自交系BTx623为材料，设置了0.05%、0.15%和0.25%三个EMS浓度处理及空白对照，通过田间观测与全基因组测序相结合，系统评估了不同EMS浓度对高粱M₁代植株农艺性状、M₂代种子发芽率以及M₃代植株突变谱的影响，旨在确定最适合构建大型FIND-IT突变体库的EMS浓度，为高粱功能基因组学研究和遗传改良提供资源支撑。

本研究主要采用了以下关键技术方法：以高粱品种BTx623为材料，用不同浓度EMS（0.05%、0.15%、0.25%）处理种子16小时后充分清洗，田间种植M₁代并系统调查植株存活率、株高、病虫害发生情况及种子产量；对M₂种子进行发芽率测试；采集M₃代植株叶片提取DNA，利用Illumina NovaSeq 6000平台进行全基因组重测序；通过生物信息学分析（CLC Genomics Workbench）检测EMS诱导突变，并利用10个未处理对照样本构建背景变异数据库以过滤自然变异；利用USC变异注释整合器（VAI）对突变进行功能注释；通过计算变异在染色体100 kb窗口内的分布均匀性（Gini指数和变异系数）评估突变的全基因组覆盖度。

2.1 田间观测

不同EMS浓度处理对M₁代植株的存活率无显著影响，但在植株生长方面表现出负相关趋势，即随着EMS浓度升高，植株生长受到抑制。

病虫害发生率在各处理间无显著差异，但总体发生率较高，可能与季节因素及BTx623品种本身抗性有关。

2.2 种子产量和发芽率

EMS浓度显著影响M₁代植株的种子产量。

0.25% EMS处理组中34%的植株不结实，而对照和0.05%处理组全部结实。M₂代种子的发芽率随EMS浓度升高而降低，0.05%处理组发芽率为80-85%，0.25%处理组降至60-70%。这表明高浓度EMS会严重降低种子产量和活力，不利于大规模突变体库的构建。

2.4 EMS处理高粱中的变异

全基因组测序结果显示，EMS诱导的突变数量与浓度呈正相关，但超过0.15%后增长幅度减小。

0.05%、0.15%和0.25% EMS处理组在全基因组范围内平均每个植株分别检测到2,301、6,188和7,827个EMS型变异（G/C至A/T转换）。编码区突变密度低于基因间区，可能源于对有害突变的选择压力。0.15%和0.25%处理组平均每个植株产生约12个提前终止密码子，而0.05%处理组仅2.6个，表明较高浓度EMS更有利于产生功能丧失型突变。

2.5 EMS诱导突变的全基因组分布

突变在全基因组分布均匀，

10条染色体上100 kb窗口的变异计数显示低Gini指数（约0.2）和变异系数（0.3-0.5），表明无显著聚类倾向，有利于实现基因组突变饱和。

2.6 基于田间和测序数据优化EMS浓度

通过综合评估种子产量和编码区突变数量，

研究发现0.10% EMS浓度可在保证每株种子产量（约20克）的同时，诱导足够数量的编码区突变（约133个错义突变），是实现突变饱和与种子产量平衡的最佳操作点。因此，推荐使用0.10%-0.15% EMS浓度构建大规模高粱突变体库。

本研究通过整合田间农艺性状评估与全基因组变异分析，明确了EMS浓度对高粱突变诱导效率及植株表型的双重影响。高浓度EMS（≥0.25%）虽能诱导更多突变，但严重降低种子产量和发芽率，不利于大规模突变体库构建；低浓度EMS（0.05%）虽农艺性状优异，但突变数量不足，难以实现基因组饱和。0.10% EMS浓度被确定为最佳平衡点，可在保持较高种子产量的同时，诱导足够数量的功能突变（尤其是提前终止密码子），为FIND-IT筛选提供理想资源。该研究不仅为高粱大型突变体库的构建提供了关键技术参数，也为其他作物EMS诱变育种提供了重要参考。所构建的突变体库将极大地促进高粱功能基因组学研究，加速抗逆、高产、优质新品种的选育进程。