基于光谱流式细胞术的抗原特异性CD8+ T细胞单细胞代谢谱解析新技术

本研究针对常规代谢分析方法难以对稀有抗原特异性T细胞进行单细胞水平解析的瓶颈，开发了一种基于光谱流式细胞术的创新工作流程。通过整合代谢蛋白染色、荧光探针和SCENITH功能性能量状态指示技术，结合MHC I类四聚体或CD137上调检测，实现了对人类和小鼠血液及组织中抗原特异性CD8+ T细胞的全面代谢特征分析，为慢性病毒感染和癌症免疫治疗研究提供了重要技术支撑。

　　

在免疫学研究领域，CD8⁺ T细胞作为适应性免疫系统的关键效应细胞，在抗病毒免疫和肿瘤免疫中发挥着至关重要的作用。然而，在慢性病毒感染和癌症环境中，抗原特异性CD8⁺ T细胞往往出现功能耗竭，其中代谢重编程异常被认为是导致T细胞功能障碍的核心机制之一。传统代谢分析方法如细胞外通量分析需要大量细胞且缺乏单细胞分辨率，而代谢组学技术也难以对稀有细胞群体进行精细分析。这些技术限制使得研究人员难以在原代样本中直接研究抗原特异性T细胞的代谢特性，通常需要体外扩增，而这又会改变细胞的原始代谢状态。

针对这一技术瓶颈，来自荷兰莱顿大学医学中心免疫学系的Nils Mülling、Ramon Arens研究团队在《Cell Reports Methods》上发表了一项创新性研究，开发了一种基于光谱流式细胞术的工作流程，能够在单细胞水平上对抗原特异性CD8⁺ T细胞进行全面的代谢特征分析。

研究人员整合了多种先进技术方法，包括使用MHC I类四聚体或CD137表达来识别抗原特异性CD8⁺ T细胞；通过抗体染色分析代谢酶和转运蛋白表达来推断通路活性；应用荧光探针测量功能性代谢和代谢物利用；以及采用SCENITH（基于翻译抑制的单细胞能量代谢分析）评估细胞能量代谢。研究样本涵盖人类外周血单核细胞（来自健康供体和急性SARS-CoV-2感染者）、人脾脏组织以及小鼠病毒感染和肿瘤模型。

代谢蛋白表达揭示抗原特异性CD8⁺ T细胞的代谢特征

研究发现，通过光谱流式细胞术分析代谢蛋白表达，能够有效区分不同分化状态的CD8⁺ T细胞亚群。初始T细胞（T_naive）表现出代谢静止状态，主要依赖氧化磷酸化（OXPHOS），而效应记忆T细胞（T_em）和终末分化效应记忆T细胞（T_emra）则更倾向于糖酵解。中央记忆T细胞（T_cm）的代谢特征与初始T细胞更为相似，显示出更强的OXPHOS依赖。

在人类巨细胞病毒（HCMV）特异性的CD8⁺ T细胞中，缺乏CD27表达的更分化细胞表现出葡萄糖转运蛋白GLUT1和丙酮酸激酶（PKM）表达增加，而ATP合成酶F1亚基α（ATP5a）和琥珀酸脱氢酶A（SDHA）表达减少，表明其糖酵解依赖性增强。研究人员还发现，在脾脏组织中，组织驻留记忆T细胞（T_rm，CD69⁺）比循环细胞表现出更高的肉碱棕榈酰转移酶1a（CPT1a）、ATP5a和SDHA丰度，表明其对脂肪酸氧化（FAO）驱动的线粒体呼吸有偏好。

激活状态改变抗原特异性CD8⁺ T细胞的代谢程序

研究团队进一步分析了静息和激活状态下HCMV特异性CD8⁺ T细胞的代谢特征。静息状态下，CD98（大型中性氨基酸转运蛋白组成部分）表达极低，而其他代谢蛋白如GLUT1、PKM、G6PD、细胞色素c、SDHA和ATP5a可检测到。激活后，营养转运蛋白CD98（细胞外）和GLUT1（细胞内）显著上调，细胞内代谢酶表达增加，表明葡萄糖和氨基酸的进口和消耗及其下游代谢处理在T细胞激活后被主动诱导。

研究还发现，代谢蛋白染色与增殖染料兼容，能够分析细胞分裂过程中的代谢蛋白表达。随着细胞周期进展，PKM、ATP5a和CPT1a表达增加，突出了T细胞激活和增殖过程中的动态代谢适应。

不同病毒特异性CD8⁺ T细胞表现出 distinct代谢特征

研究人员比较了同一宿主中针对不同病毒的抗原特异性CD8⁺ T细胞群体的代谢差异。在HCMV阳性且患有轻度急性SARS-CoV-2感染的个体中，SARS-CoV-2特异性CD8⁺ T细胞比HCMV特异性CD8⁺ T细胞表现出更高的代谢蛋白表达，包括与葡萄糖摄取（GLUT1）、线粒体呼吸（细胞色素c和SDHA）和戊糖磷酸途径（G6PD）相关的蛋白。这种差异主要源于SARS-CoV-2特异性CD8⁺ T细胞中激活的CD25阳性细胞比例更高。

感染剂量影响体内抗原特异性CD8⁺ T细胞代谢

在小鼠模型中，研究人员发现感染剂量显著影响抗原特异性CD8⁺ T细胞的代谢表型。低剂量（2×10² PFU）感染小鼠的MCMV特异性CD8⁺ T细胞表现出与线粒体FAO（CPT1a）、线粒体呼吸（细胞色素c）和戊糖磷酸途径（G6PD）相关的蛋白表达升高。而高剂量（2×10⁴ PFU）感染组则显示出更激活的效应记忆表型，表现为KLRG1表达增加以及糖酵解相关蛋白PKM和GLUT1的上调。

荧光探针揭示抗原特异性CD8⁺ T细胞的功能性代谢特性

研究团队还使用了多种荧光代谢探针来获得单细胞水平代谢特性的额外见解。2-NBDG用于指示葡萄糖摄取，BODIPY FL-C16用于指示长链脂肪酸摄取，MitoTracker Deep Red（MTDR）指示线粒体质量，TMRM指示线粒体膜电位。这些探针与MHC I类四聚体染色相结合，能够直接评估抗原特异性T细胞的代谢活性。

研究发现，中央记忆T细胞（T_cm）表现出最高的线粒体质量（由MTDR指示）和膜电位（TMRM），强调了其较高的线粒体活性。效应记忆T细胞（T_em）和终末分化效应记忆T细胞（T_emra）也比初始T细胞（T_naive）显示出增加的线粒体质量和膜电位，反映了它们在抗原再次挑战时快速增加生物能量机器的能力。

SCENITH技术评估静息和激活抗原特异性CD8⁺ T细胞的代谢能力

研究人员应用SCENITH（基于翻译抑制的单细胞能量代谢分析）技术来分析HCMV特异性CD8⁺ T细胞在静息和激活状态下的能量代谢特性。该方法通过测量嘌呤霉素 incorporation 作为蛋白质合成的间接读数，高度 correlated with ATP production。通过添加糖酵解抑制剂（2-脱氧-D-葡萄糖，2-DG）或线粒体ATP合酶抑制剂（寡霉素）或两者联合，可以评估阻断每条通路对ATP生产的影响。

研究发现，在静息期，pp65_495-503特异性CD8⁺ T细胞显示出高线粒体依赖性和升高的FAO和氨基酸氧化（AAO）能力。用pp65肽刺激3天后，通过CD137表达检测到的激活HCMV特异性CD8⁺ T细胞表现出增加的葡萄糖依赖性和糖酵解能力，反映了激活后能量需求改变的代谢需求。

研究结论与意义

该研究开发的基于光谱流式细胞术的工作流程成功实现了对抗原特异性CD8⁺ T细胞的全面代谢特征分析，解决了传统代谢分析技术无法对稀有细胞群体进行单细胞水平研究的瓶颈问题。通过整合代谢蛋白表达分析、荧光代谢探针和SCENITH功能性能量代谢评估，研究人员能够在无需细胞纯化的情况下，直接对人类和小鼠血液及组织样本中的抗原特异性T细胞进行多参数代谢分析。

研究发现揭示了不同分化状态、组织定位和激活状态的抗原特异性CD8⁺ T细胞具有 distinct 的代谢特征，这些代谢特征与它们的功能状态密切相关。在慢性感染环境中，病毒特异性CD8⁺ T细胞表现出代谢重编程，这可能是导致其功能耗竭的重要原因。此外，感染剂量能够显著影响抗原特异性T细胞的代谢表型，低剂量感染促进线粒体FAO和呼吸，而高剂量感染则促进糖酵解。

该技术的优势在于其广泛可及的流式细胞术平台，能够对抗原特异性CD8⁺ T细胞进行多参数代谢分析，这些稀有但关键的免疫细胞群体是免疫力的重要组成部分，并可作为疾病活动性和治疗反应的有用生物标志物。虽然研究聚焦于病毒特异性CD8⁺ T细胞，但MHC I类四聚体和CD137 based identification 的使用使该方法学可扩展到其他病原体、肿瘤和自身免疫 conditions，支持在不同研究领域的广泛应用。

研究的局限性在于流式细胞术 based profiling 通过探针和抗体选择提供有针对性的代谢状态见解，而组学方法（如转录组学和代谢组学）提供更广泛的覆盖范围，但目前受细胞数量要求的限制，特别是对于像抗原特异性T细胞这样的稀有群体。持续发展的组学技术可能最终克服这些限制，实现对稀缺细胞亚群在单细胞水平上的更全面分析。

总之，这项研究为免疫代谢研究提供了强有力的技术平台，能够深入探索抗原特异性T细胞在生理和病理状态下的代谢调控机制，为开发针对慢性感染和癌症的代谢干预策略提供了重要理论基础和技术支持。