靶向CD19和CD20的双价适体组装体在B细胞淋巴瘤中的内化机制与治疗潜力

本研究针对B细胞恶性肿瘤治疗中单克隆抗体存在成本高、工艺复杂的问题，通过配体引导筛选技术开发了靶向CD19和CD20的双价核酸适体。研究发现CD19适体的内化作用受共受体CD21表达的负调控，而CD20适体虽能增强抗原结合但不会诱导钙离子释放。这些适体展现出与单克隆抗体相似的功能特性，为DLBCL等B细胞恶性肿瘤提供了新型核酸类治疗策略。

　　

在B细胞恶性肿瘤和自身免疫性疾病的治疗领域，科学家们一直在寻找能够精准靶向病变B细胞的有效方法。CD19和CD20作为B细胞表面特异性标志物，已成为治疗性抗体药物的热门靶点，其中利妥昔单抗(抗CD20单抗)和抗CD19 CAR-T细胞疗法已显示出临床效益。然而，单克隆抗体药物存在生产成本高、工艺复杂、免疫原性等问题，限制了其广泛应用。

为此，Prabodhika Mallikaratchy团队采用了一种创新性的配体引导筛选(ligand-guided selection, LIGS)技术，这是一种系统性进化配体指数富集(SELEX)方法的变体，能够直接从活细胞表面筛选出高亲和力、高特异性的核酸适体(aptamer)。核酸适体是一类短链单链DNA或RNA分子，能够折叠成特定的三维结构，与靶标分子高亲和力结合，具有合成简便、稳定性好、免疫原性低等优势。

在这项发表于《Molecular Therapy Nucleic Acids》的研究中，研究人员重点研究了针对CD19和CD20的双价适体组装体的生化功能特征。为了优化适体性能，团队首先对先前筛选得到的抗CD19适体(WB15.CD19和WB17.CD19)和抗CD20适体(WB1.CD20)进行了截短改造，通过去除非必需区域获得了更短的变体，同时保持其结构完整性和结合亲和力。

研究采用的主要技术方法包括：配体引导筛选(LIGS)技术获得特异性适体、流式细胞术进行结合亲和力和特异性分析、蛋白质酶K消化法检测适体内化、共聚焦显微镜观察适体与抗体的共定位、荧光钙指示剂Fluo-4 AM检测钙离子释放。使用的细胞模型包括多种B细胞淋巴瘤细胞系(如Raji、Toledo、BJAB、Ramos、SKLY-16等)以及CD19/CD20敲除的CA46细胞作为阴性对照。

Truncation and binding affinity analysis of anti-CD19 and anti-CD20 aptamers

研究人员通过对WB15.CD19和WB17.CD19进行3'端去除8个碱基和5'端去除4个碱基的截短，获得了WB15.CD19.1和WB17.CD19.1变体，这两种变体表现出与亲本适体相似的结合能力。然而，进一步截短21-25个碱基的WB15.CD19.2和WB17.CD19.2变体则完全失去了结合能力，表明这些区域对维持适体结构至关重要。类似地，抗CD20适体WB1.CD20经过截短产生的WB1.CD20.1变体显示出改善的表观亲和力，而更短的WB1.CD20.2和WB1.CD20.3变体则丧失了结合能力。

Specificity of truncated anti-CD19 and anti-CD20 aptamer variants

通过流式细胞术分析，研究人员证实了WB1.CD20.1变体对CD20阳性细胞系(包括Raji、BJAB、SKLY-16和Toledo)的特异性结合，而不结合CD20阴性细胞(Jurkat.E6和CD20KO CA46细胞)。同样，CD19变体WB15.CD19.1和WB17.CD19.1也显示出对CD19阳性细胞的特异性结合。荧光显微镜分析进一步表明，截短的CD19适体WB17.CD19.1和截短的CD20适体WB1.CD20.1能够与各自的单克隆抗体共定位，证实了它们的靶标特异性。

Dimerization of anti-CD19 and anti-CD20 aptamers

为了提高适体的表观亲和力，研究人员使用聚乙二醇(PEG)连接剂将抗CD20和抗CD19适体二聚化。通过系统优化连接剂长度，发现含有三个间隔单元(约3.96 nm)的WB1/1.CD20.1_3S在4°C和37°C下都表现出最佳结合亲和力(K_d = 15 ± 7.4 nM)。类似地，针对CD19的同源二聚体适体WB17/17.CD19.1_3S和WB15/15.CD19.1_3S也显示出纳摩尔级的亲和力。有趣的是，温度对适体结合有显著影响，较短连接体的二聚体在4°C下形成分子内相互作用，而在37°C下这些相互作用被破坏，结合亲和力反而提高。

Specificity of dimerized anti-CD19 and anti-CD20 aptamers

二聚化适体在37°C下仍保持高度特异性，能够特异性结合所有五种CD19和CD20阳性淋巴瘤细胞系，而不结合CD19/CD20阴性细胞。共聚焦显微镜分析证实了WB1/1.CD20.1_3S与抗CD20抗体在Raj细胞膜上的共定位，以及WB17/17.CD19.1_3S与抗CD19抗体的共定位，进一步验证了截短二聚化适体的特异性。

Internalization kinetics of dimeric CD19 aptamers

研究人员开发了一种基于蛋白质酶K消化的方法来研究适体内化。研究发现，抗CD19抗体和二聚CD19适体在CD21阴性的Ramos细胞中能够有效内化，而在CD21阳性的Raji和Toledo细胞中则几乎不内化。这种内化模式与先前报道的抗CD19单克隆抗体内化受CD21表达抑制的现象一致。在弥漫大B细胞淋巴瘤(DLBCL)细胞系OCI-LY7和HBL-1(CD21阴性)中，三种测试的二聚CD19适体都显示出特异性结合和有效内化。

Dimeric anti-CD20 aptamer does not induce intracellular calcium release in DLBCL cell lines

通过钙离子释放实验，研究人员发现三种二聚适体(WB15/15.CD19.1_3S、WB17/17.CD19.1_3S和WB1/1.CD20.1_3S)在三种DLBCL细胞系(OCI-LY7、HBL-1和Karpas 422)中均不诱导显著的钙动员，与随机DNA阴性对照相似，而1% Triton X-100阳性对照则引起强烈的钙信号。这表明这些适体在测试条件下不调节钙信号传导。

研究结论表明，LIGS生成的适体能够复制单克隆抗体的关键功能特征：CD19适体的内化作用受CD21共受体表达的负调控，模仿了抗CD19抗体的行为；而CD20适体虽然增强抗原结合但不诱导钙释放，与某些治疗性抗CD20抗体的特性相似。这些发现强调了LIGS生成的适体作为抗体治疗的有效和靶向治疗替代品的潜力。

讨论部分指出，大约30%的DLBCL病例缺乏CD21表达，另外30%表现出低CD21水平，这表明抗CD19适体的选择性内化特性可能有助于设计针对DLBCL的靶向治疗。此外，二聚抗CD20适体缺乏内化能力表明它们可能更适合用于设计双特异性适体或作为靶向载体而非内化载体。

这项研究的重要意义在于提供了关于核酸适体功能特性的深入理解，特别是它们与细胞表面受体相互作用的机制。这些双价核酸适体作为靶向治疗剂，为B细胞相关恶性肿瘤如弥漫大B细胞淋巴瘤(DLBCL)提供了一种成本效益高、可扩展的替代方案，扩展了可用治疗分子的 repertoire，并推进了具有强大临床潜力的基于适体的合成治疗剂的发展。