基質硬度決定WI-38細胞走向增殖停滯的獨特路徑：JUNB介導的機械信號轉導新機制

本研究由Calico Life Sciences團隊開展，針對細胞機械微環境如何影響複製性衰老這一未解問題，通過系統性操控基質硬度（0.5 kPa至2.3 GPa），結合多組學分析發現：基質軟化通過誘導AP-1轉錄因子（特別是JUNB）程序性激活，驅動WI-38細胞提前進入增殖停滯狀態，而hTERT表達可逆轉此過程。該研究首次揭示機械信號與端粒依賴性衰老的交叉對話，為理解組織纖維化與衰老提供新視角。論文發表於《GeroScience》並開源數據（GEO: GSE276045-8）。

　　

自1965年Leonard Hayflick發現人類二倍體細胞具有有限複製潛能以來，複製性衰老（replicative senescence）已成為細胞衰老研究的基石模型。隨著複製次數增加，端粒逐漸縮短並最終觸發DNA損傷反應，導致細胞不可逆地退出細胞週期。雖然端粒酶逆轉錄酶（hTERT）的異位表達可通過維持端粒長度實現細胞永生化，但自然狀態下細胞如何感知微環境信號並調控衰老進程，仍是未解之謎。

近年研究發現，WI-38人肺纖維母細胞在衰老過程中呈現出顯著的機械信號相關特徵：包括YAP信號通路激活、上皮-間質轉化（EMT）基因表達上調以及肌纖維母細胞標記物誘導。這些現象暗示機械微環境可能與複製性衰老存在潛在關聯。尤其值得注意的是，當使用YAP抑制劑verteporfin處理晚期WI-38細胞時，可逆轉上述表型，但長期抑制YAP會導致細胞死亡，這促使研究人員思考：能否通過調節細胞外基質硬度這一物理性因素，而非化學抑制，來模擬YAP抑制效果並延長複製壽命？

傳統觀點認為，軟化基質應能減輕細胞所受機械力，可能延緩衰老進程。但令人驚訝的是，Calico Life Sciences團隊的最新研究發現了截然相反的現象：基質軟化非但沒有延長細胞壽命，反而加速了WI-38細胞的增殖停滯。這項發表於《GeroScience》的研究，通過為期數月的縱向實驗證明，細胞在軟基質（0.5-32 kPa）上培養時，會提前出現衰老相關β-半乳糖苷酶（SA-β-gal）活性升高、細胞形態擴大等典型衰老表型，且增殖壽命顯著縮短。更引人注目的是，hTERT表達可完全逆轉軟基質誘導的表型，即便在端粒未發生嚴重縮短的情況下亦然，提示TERT可能通過非經典功能參與機械信號調控。

為深入解析這一現象的內在機制，研究團隊運用多組學技術手段，包括批量RNA測序、單細胞RNA測序（scRNA-seq）、ATAC測序（檢測染色質可及性）以及端粒長度定量分析。研究設計涵蓋了不同硬度基質（從模擬健康肺組織的0.5 kPa到仿眞纖維化肺的32 kPa，直至標準培養皿的2.3 GPa），並平行比較野生型WI-38細胞與hTERT永生化細胞在不同時間點的動態變化。

關鍵技術方法包括：通過聚二甲基矽氧烷（PDMS）和聚丙烯醯胺（PA）水凝膠構建可調硬度基質；利用定量PCR（qPCR）測量相對端粒長度；採用Senescence β-Galactosidase Staining Kit進行衰老表型檢測；借助SCI-RNA-seq3平台實現高通量單細胞轉錄組分析；通過HOMER軟件進行轉錄因子 motif富集分析。

研究結果首先證實基質硬度對增殖能力的顯著影響：野生型WI-38細胞在軟基質（0.5 kPa）上僅培養3-4週即發生快速增殖停滯，而在硬質基質（2.3 GPa）上可持續增殖超過3個月。引人注目的是，這種硬度依賴性效應在多種材料（PDMS、PA）上均保持一致，排除材料特異性干擾。hTERT表達則使細胞在所有基質上均維持穩定增殖，證實端粒酶活性對機械誘導衰老的保護作用。

在分子表型層面，SA-β-gal染色顯示軟基質上培養的野生型細胞早在2週時就出現衰老標記陽性，4週時陽性率達30-60%，而硬質基質上同期細胞幾乎無陽性表現。形態學分析進一步顯示，軟基質上的細胞提前出現衰老典型的細胞擴大和鋪展現象。

轉錄組學分析揭示更深入的機制：雖然硬度不同的基質上細胞整體衰老相關基因表達模式相似（如CDKN1A、CDKN2A、CDKN2B等細胞週期抑制因子上調），但軟基質特異性地抑制了衰老相關分泌表型（SASP）基因（如IL-1α、MMP3）的誘導。更重要的是，ATAC測序發現軟基質導致野生型細胞中AP-1轉錄因子結合位點的染色質可及性特異性增加，特別是對12-O-十四烷酰佛波醇-13-乙酸酯（TPA）應答元件（TRE）的親和性增強。

單細胞轉錄組分析提供了細胞異質性的視角：研究發現不同硬度和基因型條件下，細胞在G1期形成截然不同的狀態集群。特別地，軟基質上的野生型細胞形成獨特的G1細胞群（集群3），其基因標記富集於應激信號通路，且AP-1靶基因顯著激活。轉錄因子結合 motif分析進一步確認，這群細胞中JUN/FOS家族結合元件高度富集。

機制探索方面，研究團隊發現JUNB（AP-1複合物的關鍵組分）在軟基質上的野生型細胞中隨時間推移持續上調，而其他AP-1組分（如JUN、JUND）則無此規律。功能實驗證實，過表達JUNB足以抑制WI-38細胞增殖，而TGF-β1處理可上調JUNB表達並同樣抑制增殖，提示TGF-β-JUNB信號軸可能在機械信號轉導中發揮核心作用。值得注意的是，儘管軟基質加速了端粒縮短速率（每細胞代次損失更多端粒長度），但細胞發生增殖停滯時的平均端粒長度僅縮短約38%，遠低於硬質基質上複製性衰老時觀察到的80%縮短程度，表明軟基質誘導的停滯並非主要由端粒損傷驅動。

研究結論指出，基質軟化通過激活JUNB依賴的AP-1轉錄程序，驅使WI-38細胞走向一種獨特的增殖停滯狀態，這種狀態與經典複製性衰老既有相似之處（如細胞週期抑制因子上調、EMT程序激活），又存在本質區別（端粒長度閾值不同、SASP表達抑制）。hTERT表達可通過尚未闡明的非經典功能逆轉這一過程，揭示端粒酶與機械信號轉導間的新型交叉對話。

這項研究的意義在於首次系統闡明機械微環境硬度如何調控細胞複製壽命，挑戰了“基質軟化延緩衰老”的直覺預期，揭示JUNB作為機械信號新型效應器的功能。從疾病角度，這些發現為理解組織纖維化（伴隨基質硬化）與衰老相關病理提供了新視角，為靶向機械生物學的干預策略開發奠定基礎。未來研究需深入解析TERT如何調控機械應答，以及JUNB上游的機械感應機制，這些工作將為對抗年齡相關疾病提供新思路。