溶酶体LRRC8复合体调控溶酶体pH与形态影响全身葡萄糖代谢及胰岛素敏感性的机制研究

为解决溶酶体功能异常如何影响代谢性疾病的问题，研究人员开展LRRC8离子通道复合体在溶酶体中的定位与功能研究，发现其通过调节溶酶体pH、形态及自噬流，影响PI3K-AKT-mTOR信号通路和胰岛素敏感性；突变体小鼠表现为肥胖、糖耐量受损和系统性胰岛素抵抗，揭示溶酶体离子通道在代谢调控中的新机制。

　　

溶酶体作为细胞内的关键降解器官，不仅负责回收胞内外大分子物质，还参与营养感知和信号转导，维持细胞稳态。近年来，研究发现溶酶体功能紊乱与多种代谢性疾病如2型糖尿病、肥胖等密切相关。然而，溶酶体离子通道在调控其pH值、形态以及下游信号通路中的作用机制尚不完全清楚。尤其值得注意的是，富含亮氨酸重复序列的8（LRRC8）蛋白家族构成的离子通道复合体，已知在细胞体积调节中起作用，但其在溶酶体中的存在和功能却鲜有报道。这一知识空白限制了我们对溶酶体在代谢调控中深层机制的理解，也阻碍了相关治疗策略的开发。

为了深入探究LRRC8复合体在溶酶体中的功能及其对全身代谢的影响，研究人员开展了一系列实验，最终将研究成果发表在《SCIENCE ADVANCES》上。该研究不仅证实了LRRC8复合体在溶酶体膜上的定位，还揭示了其通过调节溶酶体酸碱度和形态，影响关键信号通路和全身葡萄糖稳态的新机制，为代谢性疾病的治疗提供了新的潜在靶点。

在研究过程中，作者运用了多种先进的技术方法。主要包括：通过CRISPR-Cas9基因编辑技术构建LRRC8A-3×Flag knock-in（KI）和LRRC8A-L706A;L707A-3×Flag（LL:AA）点突变基因敲入小鼠模型，用于体内功能研究；利用溶酶体免疫沉淀（Lyso-IP）技术结合Western blot（WB）分析，验证内源性LRRC8亚基在溶酶体中的定位及组成；采用全细胞膜片钳技术记录体积调节性阴离子通道（VRAC）电流，评估LRRC8通道的功能活性；通过活细胞和固定细胞的共聚焦显微镜及受激发射损耗（STED）超分辨率成像技术，直观显示LRRC8A与溶酶体标记物LAMP1的共定位；借助透射电子显微镜（TEM）观察溶酶体形态变化，并利用比率计量荧光探针LysoSensor测量溶酶体pH值；开展体内葡萄糖耐受试验（GTT）、胰岛素耐受试验（ITT）以及高胰岛素-正葡萄糖钳夹技术（Euglycemic-hyperinsulinemic clamp），全面评估系统性葡萄糖稳态和胰岛素敏感性；最后，通过RNA测序（RNA-seq）和 ingenuity pathway analysis（IPA）分析，揭示差异表达基因及相关信号通路的变化。

研究结果部分，作者通过多个实验层层深入地揭示了LRRC8复合体的功能。

LRRC8复合体驻留于原生组织的溶酶体中

研究人员首先通过构建可诱导表达LAMP1-RFP-2×Flag-TEV-HA的转基因小鼠，分离原代骨骼肌细胞并进行溶酶体免疫沉淀（Lyso-IP）。结果显示，LRRC8A、LRRC8B、LRRC8D和少量LRRC8E亚基与溶酶体标志物共沉淀，而LRRC8C则缺失，表明骨骼肌溶酶体LRRC8通道主要由LRRC8A、B和D亚基构成。此外，利用CRISPR-Cas9技术构建的LRRC8A-3×Flag KI小鼠也证实了内源性LRRC8A定位于溶酶体。成像实验进一步显示，ALFA表位标记的LRRC8A与LysoTracker染色的溶酶体共定位，STED超分辨成像清晰展示了LRRC8A在溶酶体膜上的环状结构。这些发现共同证实了LRRC8复合体存在于溶酶体亚群中。

LRRC8A调节亮氨酸刺激的AKT-mTOR信号

在营养感知方面，研究发现LRRC8A缺失显著削弱了亮氨酸（5 mM）刺激的mTOR信号通路 activation，表现为磷酸化p70 S6K和S6蛋白水平的降低。这一现象在LRRC8A敲除（KO）的C2C12肌管细胞、原代肌管细胞以及短发夹RNA（shRNA）介导的LRRC8A敲低（KD）细胞中均得到验证。其他氨基酸如异亮氨酸和精氨酸的刺激效果较弱，且反应不一，突显了亮氨酸在LRRC8A依赖的mTOR signaling中的特异性作用。

LRRC8A缺失改变溶酶体大小、形态、自噬标志蛋白表达及pH

透射电镜（TEM）显示，LRRC8A KO细胞中溶酶体表面积增大67%，圆形度指数降低，提示形态异常。RNA-seq数据分析发现，多个细胞类型中溶酶体生物发生和自噬相关基因（如TFEB、LAMP1、LAMP2、p62、LC3）的表达显著改变。Western blot结果进一步证实LAMP1/2蛋白水平上升，自噬标志物p62和LC3-II积累，表明自噬流受损。更重要的是，Lysosensor测量发现LRRC8A KO细胞溶酶体pH降低，即酸化增强，而V-ATPase抑制剂Baf A1处理可逆转这一现象。这些结果表明LRRC8A是溶酶体形态、pH和功能的关键调节因子。

突变LRRC8A溶酶体靶向序列（LRRC8A-L706A;L707A）选择性减少溶酶体中的LRRC8A

为特异性消除溶酶体LRRC8通道而保留质膜功能，研究人员构建了LRRC8A双亮氨酸突变（LL:AA）KI小鼠。膜片钳记录证实LL:AA突变体在质膜上形成功能正常的VRAC通道。然而，Lyso-IP和免疫荧光显示，LL:AA突变体在溶酶体中的定位显著减少，而与LAMP1的共定位相关性下降。这表明L706和L707是LRRC8A溶酶体靶向的关键序列。

溶酶体LRRC8A缺失的肌管RNA-seq显示炎症、自噬和代谢信号通路相关基因差异表达

RNA-seq分析发现，LL:AA肌管中补体系统激活标志基因（如C1q、C3）、溶酶体组织蛋白酶（CTSS、CTSB、CTSL）和吞噬相关基因表达上调。IPA分析提示PTEN、PI3K-AKT、PIP3等信号通路下调，而细胞外基质（ECM）发育、补体级联等通路激活。这些变化与溶酶体功能紊乱和代谢性疾病相关。

选择性缺失溶酶体LRRC8A重现LRRC8A KO肌管中溶酶体形态、pH和细胞内信号缺陷

LL:AA肌管表现出与LRRC8A KO细胞类似的表型：溶酶体体积增大、LAMP1/2蛋白表达升高、pH降低。更重要的是，基础状态下的PI3K-AKT-pAS160 signaling减弱，胰岛素刺激的pAKT1和pAKT2水平下降。重新表达野生型LRRC8A可恢复LRRC8A KO细胞的信号传导，而LL:AA突变体则不能，突显了溶酶体LRRC8定位对胰岛素信号的重要性。

羟氯喹和Baf A1溶酶体碱化恢复LRRC8A KO肌管中的胰岛素信号

用羟氯喹（HCQ）或Baf A1处理LRRC8A KO细胞，使溶酶体碱化后，胰岛素刺激的pAKT2水平得以恢复。这表明LRRC8A缺失导致的胰岛素信号受损可能与溶酶体过度酸化有关，而非一般性细胞毒性。

LRRC8A-LL:AA KI小鼠表现出葡萄糖耐受不良、胰岛素抵抗和肥胖增加

体内实验显示，LL:AA小鼠在常规饮食下出现葡萄糖耐受不良、胰岛素抵抗，随年龄增长体脂增加。高胰岛素-正葡萄糖钳夹实验证实系统性胰岛素抵抗，骨骼肌葡萄糖摄取减少，肝葡萄糖产生增加。分子水平上，LL:AA小鼠骨骼肌中胰岛素刺激的PI3K-AKT-mTOR信号通路活性降低。这些结果说明溶酶体LRRC8通道是维持全身葡萄糖稳态和胰岛素敏感性的必要条件。

综上所述，本研究首次全面揭示了LRRC8离子通道复合体在溶酶体中的定位及其多功能调控作用。该通道通过影响溶酶体pH、形态、自噬流和关键信号通路（如PI3K-AKT-mTOR），在细胞代谢和全身葡萄糖稳态中发挥核心作用。突变体小鼠模型证明，特异性破坏溶酶体LRRC8（而非质膜LRRC8）足以引发肥胖、胰岛素抵抗和糖代谢紊乱。这不仅深化了我们对溶酶体在代谢疾病中作用机制的理解，而且为未来治疗策略（如靶向溶酶体离子通道）提供了重要理论依据和实验基础。