人类前体T滤泡调节细胞（preTfr）定位于分化为成熟Tfr并在严重感染期间功能受损

本刊推荐：研究人员为阐明T滤泡调节细胞（Tfr）的形成阶段及在严重感染中的变化，开展了对循环中na?ve样表型preTfr（CD45RA+CD45RO?Foxp3+CXCR5+）的系统研究。发现preTfr具有体外扩增能力和抑制功能，在COVID-19和脓毒症患者中显著减少，且与抗IFN-γ自身抗体增加相关。该研究揭示了Tfr在疾病早期形成阶段被破坏的机制，为疫苗开发和自身免疫病治疗提供了新靶点。

　　

在免疫学的精细调控网络中，调节性T细胞（T_reg）扮演着维持自身免疫耐受和防止自身抗体产生的关键角色。其中，滤泡辅助性T细胞（Tfh）驱动B细胞在生发中心成熟并产生抗体，而T滤泡调节细胞（Tfr）则专门负责抑制Tfh细胞，从而精准调控生发中心的免疫应答，防止过度的抗体生成和自身免疫病的发生。然而，尽管Tfr细胞的重要性日益凸显，其发育分化的具体阶段、功能特性以及在病理条件下的动态变化，尤其是严重感染过程中的表现，仍是未解之谜。

先前研究表明，人类血液和淋巴器官中存在相当比例的Tfr细胞，甚至可占扁桃体中总T_reg细胞的50%。有报道提及循环Tfr中存在CD45RA⁺和CD45RA^?的群体，并推测CD45RA⁺亚群可能是更具活性的CD45RA^?亚群的前体细胞，但缺乏直接的证据支持。理解Tfr细胞，特别是循环中na?ve样（CD45RA⁺）的Tfr前体细胞（preTfr）的表型和功能细微差别，对于深化免疫调控认知、开发自身免疫病及其他免疫相关疾病的治疗策略至关重要。

为了回答这些问题，研究人员开展了一项深入的研究，发现30-50%的人类循环Tfr具有na?ve样表型（preTfr, CD45RA⁺CD45RO^?Foxp3⁺CXCR5⁺）。这些preTfr在体外具有扩增能力并保留抑制功能。它们在转录水平上与na?ve T_regs（nT_regs）相似，但刺激后能获得更高的Tfr相关抑制分子如IL-1RA的表达，表明它们已为完全分化为成熟Tfr做好准备。更重要的是，在COVID-19和脓毒症患者血液中，preTfr而非nT_reg显著减少，且这种减少与抗干扰素-γ（IFN-γ）自身抗体增加和活化的非典型B细胞相关。这些数据表明，在严重疾病期间，Tfr在其形成的最早阶段即被破坏，可能成为未来疫苗开发中的重要治疗靶点。该研究成果发表在《科学进展》（SCIENCE ADVANCES）上。

为开展此项研究，研究人员综合运用了多种关键技术。研究队列包括重症COVID-19患者、细菌性脓毒症患者以及接种了辉瑞mRNA疫苗的医护人员队列的纵向样本。核心技术手段包括高维质谱流式细胞术（CyTOF）用于深度免疫表型分析，以区分不同的T_reg和Tfr亚群；RNA测序（RNA-seq）用于揭示preTfr与其他亚群的转录组差异；荧光激活细胞分选（FACS）用于分离特定细胞群体进行体外功能验证；以及一系列的体外功能实验，如细胞扩增培养、B细胞抑制实验、T细胞抑制实验和伤口愈合实验，用以评估preTfr的功能特性。此外，还通过多重微球阵列和酶联免疫吸附测定（ELISA）检测了血浆中的自身抗体和细胞因子水平。

研究结果

Identification of CD45RA-expressing Tfr in blood（血液中表达CD45RA的Tfr的鉴定）

通过重新分析已发表的人外周血单个核细胞（PBMC）数据集，研究人员在关注T_reg亚群表型时，除了已知的CD45RO⁺效应Tfr（eTfr）外，还观察到了一群CD45RA⁺CXCR5⁺的细胞，将其定义为na?ve样前体Tfr（preTfr）细胞。

preTfr frequency is altered in patients with COVID-19 and patients with sepsis（preTfr的频率在COVID-19和脓毒症患者中发生改变）

纵向队列分析显示，与年龄匹配的健康对照相比，COVID-19患者和脓毒症早期患者的循环效应Tfr（cTfr）和preTfr细胞均显著减少，而na?ve T_regs（nT_regs）则基本稳定，表明preTfr和nT_reg对疾病的反应模式不同。表型上，preTfr主要通过CXCR5与nT_regs区分开。在COVID-19中，preTfr频率较低与死亡率增加相关，提示其可能具有保护功能。

preTfr frequency negatively correlates with anti-cytokine autoantibodies（preTfr频率与抗细胞因子自身抗体呈负相关）

Tfr在调控自身抗体中起关键作用。研究发现，在COVID-19后期，preTfr和cTfr的频率与抗IFN-γ自身抗体水平呈显著负相关。抗IFN-γ自身抗体阳性的COVID-19患者中，nT_reg百分比更高，而cTfr和preTfr百分比更低，同时CD45RB^lo活化非典型B细胞亚群更高，这些B细胞与多种抗细胞因子自身抗体正相关，与T_reg亚群负相关。

preTfr respond to SARS-CoV-2 mRNA vaccination（preTfr对SARS-CoV-2 mRNA疫苗接种产生应答）

在接种BNT162b2 mRNA疫苗的医护人员队列中，preTfr和cTfr的频率在接种后显著增加，尤其是在后期时间点，而nT_regs基本无变化。相关性分析表明，preTfr和cTfr与cTfh和CD45RB^lo活化非典型B细胞（与疫苗抗体反应强烈相关）呈正相关。与年龄的关系分析显示，preTfr的频率随年龄变化不明显，表明其可能是一个更稳定的亚群。

Na?ve-like Tfr have a distinct transcriptional profile（Na?ve样Tfr具有独特的转录谱）

通过RNA-seq分析分选出的preTfr、cTfr、nT_reg和eT_regs，主成分分析（PCA）显示na?ve和效应T_reg及Tfr群体之间存在清晰分离。差异表达基因分析发现，有10个基因在T_reg和Tfr亚群之间持续差异表达，包括CXCR5和FCRL3（一种Tfr相关抑制分子）。基因本体分析显示这些基因参与白细胞活化和粘附的负调控。preTfr与nT_reg相比，TIGIT表达显著更高，BCL6有升高趋势但表达水平很低。

preTfr are expandable and have suppressive activity in vitro（preTfr可在体外扩增并具有抑制活性）

体外扩增实验表明，preTfr和nT_reg均可在含有IL-2、IL-12和激活素A的细胞因子混合物中长时间（可达64天）扩增，表明两者均具有干细胞样的扩增能力。在B细胞抑制实验中，preTfr和nT_reg同样能有效抑制由 na?ve B细胞产生的浆母细胞生成。在经典的T细胞抑制实验中，两者也能以相似的效果抑制常规T细胞的增殖。

preTfr secrete IL-1RA, which suppresses plasmablast generation（preTfr分泌IL-1RA，从而抑制浆母细胞生成）

在Tfr促进条件（TPC，含IL-12, IL-21, IL-23, TGF-β）下培养后，preTfr的Foxp3和Helios表达略高于nT_regs，BCL6和CXCR5表达在两组中均被诱导/维持。RNA-seq显示，在TPC条件下，preTfr和nT_reg的转录组差异显著扩大。抑制分子FCRL3、IL1RN（编码IL-1RA）和IL1R2在preTfr中的表达更高。ELISA证实preTfr培养上清液中的IL-1RA蛋白水平更高。功能实验表明，重组IL-1RA可减少浆母细胞形成，而抗IL-1RA阻断性单抗可逆转此效应。在总PBMC抑制实验中，preTfr和nT_reg上清液均能抑制浆母细胞形成，但只有preTfr上清液的抑制效果可被抗IL-1RA处理显著影响。

preTfr has enhanced wound healing capacity（preTfr具有增强的伤口愈合能力）

基因本体分析提示TPC条件下的preTfr差异表达基因与再生有关。伤口愈合实验表明，与nT_reg相比，preTfr在TPC条件下产生的上清液能显著增强人角质形成细胞（HaCaT）的划痕愈合能力，这揭示了preTfr的一种非经典功能，进一步将其与nT_regs区分开来。

preTfr and intermediate groups identified in human tonsils（在人扁桃体中鉴定出的preTfr及中间群体）

对人扁桃体组织的质谱流式分析揭示了T_reg亚群的完整谱系，包括经典的nT_regs、eT_regs和多个eTfr群体。同时也观察到了两个高表达CD45RA的Tfr群体（preTfr），它们还表达CCR7和TCF1等na?ve细胞标志物，而缺乏CD45RO、PD1和CD95等效应标志物。其中一个亚群低表达CD69、CD45RO和CD95，被认为是处于从preTfr向组织驻留CD69⁺ Tfr群体过渡的早期阶段。此外，在脐带血中几乎不存在CD45RA⁺ Tfr，提示这些细胞在外周发育。

讨论与结论

本研究系统性地鉴定并深入表征了人类循环系统中的一种新型免疫细胞亚群——na?ve样T滤泡调节前体细胞（preTfr）。研究结果表明，preTfr（CD45RA⁺CXCR5⁺Foxp3⁺）在表型和转录水平上虽与na?ve T_regs（nT_regs）相似，但构成一个独特的群体。它们具备强大的体外扩增能力和免疫抑制功能。更重要的是，在适当的刺激条件下（如TPC），preTfr会上调Tfr特异的抑制分子如IL-1RA的表达，并展现出增强的伤口愈合能力，表明它们已为分化为功能成熟的Tfr细胞做好了准备，并可能具备多方面的功能。

研究的临床意义尤为突出。在COVID-19和脓毒症等严重感染性疾病中，preTfr（而非nT_regs）的频率显著降低，且这种减少与患者体内抗IFN-γ自身抗体水平升高以及活化的非典型B细胞增多相关。preTfr频率过低还与COVID-19患者死亡率增加相关。相反，在接种SARS-CoV-2 mRNA疫苗后，preTfr的频率会升高，并与疫苗反应性细胞（如cTfh和活化B细胞）正相关。这些发现强烈提示，preTfr是维持体液免疫应答平衡、防止自身抗体产生的关键早期调控者。在严重感染中，Tfr细胞的分化在最早阶段即被破坏，可能导致免疫失调和自身免疫；而在可控的疫苗接种中，preTfr能够正常应答并可能参与调控适当的抗体反应。

此外，该研究对基于T_reg的细胞治疗具有启示意义。目前临床上使用的CD45RA⁺ T_regs产品实际上是CXCR5阳性（preTfr）和阴性（nT_reg）细胞的混合群体。特异性分离和扩增preTfr亚群，可能为治疗以自身抗体为特征的自身免疫病（如系统性红斑狼疮）提供一种更具靶向性的新策略。

综上所述，该项研究不仅揭示了Tfr细胞发育早期的一个关键前体阶段，阐明了其在严重感染和疫苗接种中的动态变化和潜在功能，而且为理解相关疾病的免疫机制、开发新的治疗和疫苗策略提供了重要的理论依据和实验基础。preTfr作为一个新的免疫治疗靶点，未来值得深入探索。