工程化基底膜仿生水凝胶揭示乳腺上皮形态发生与侵袭的力学-生化耦合调控机制

本研究针对传统重建基底膜（rBM）产品存在批次差异、异源污染及力学特性不可控等问题，开发了肽缀合藻酸盐水凝胶构建的工程化基底膜（eBM）平台。通过独立调控基质刚度（弹性模量）和应力松弛速率，结合特异性黏附肽（IKVAV/YIGSR/RGD）修饰，研究人员发现软质快速松弛的IKVAV改性eBM支持正常乳腺腺泡形成，而刚性与慢松弛协同作用诱导侵袭表型。该研究揭示了β1/β4整合素信号平衡、半桥粒形成和层粘连蛋白沉积的调控机制，为组织工程和疾病建模提供了可定制的无异源平台。

　　

在乳腺生物学研究领域，三维细胞培养模型已成为模拟体内微环境不可或缺的工具。传统重建基底膜（reconstituted basement membrane, rBM）提取物（如Matrigel、Cultrex和Geltrex）虽被广泛应用，但其存在明显的局限性：批次间差异大、含有未定义的生长因子和信号分子、存在异源污染物，且缺乏机械和生化特性的可调性。这些缺陷严重限制了其在机制研究中的应用，特别是在探究细胞外基质（ECM）的机械和生化特性如何独立及协同调控细胞行为方面。乳腺上皮细胞（Mammary Epithelial Cells, MECs）的形态发生和肿瘤进展深受其周围三维微环境的影响，尤其是基底膜蛋白直接与MECs接触，调控其表型和极化。因此，开发一种成分明确、性质可调的无rBM系统，对于精确解析ECM特性在乳腺上皮正常形态发生和恶性转化中的作用至关重要。

为了克服这些挑战，研究人员在《科学进展》（SCIENCE ADVANCES）上发表了一项研究，他们开发了一种基于藻酸盐的工程化基底膜（engineered basement membrane, eBM）系统。该研究主要运用了以下关键技术方法：1）利用碳二亚胺化学将基底膜来源的黏附肽序列（IKVAV、YIGSR、RGD）共价缀合到纯化的藻酸盐聚合物上，实现对生化信号的精确控制；2）通过调节钙离子（Ca²⁺）交联浓度和选用不同分子量的藻酸盐，独立调控水凝胶的弹性模量（刚度）和应力松弛速率（应力松弛半衰期τ_1/2），从而构建具有不同力学特性的基质；3）采用流变学测量（包括时间扫描和应力松弛测试）对制备的eBM进行力学表征；4）将多种细胞类型（包括MCF10A、MCF7细胞系、小鼠乳腺类器官以及患者来源的PDM-350类器官）封装于eBM中进行三维培养，并通过免疫荧光染色、共聚焦显微镜成像及图像分析定量评估细胞簇的形态、极化、侵袭以及关键蛋白（如整合素、层粘连蛋白、半桥粒组分）的表达与定位。

藻酸盐网络可实现机械和生化特性的独立调控

研究人员证实，通过调整钙交联浓度可独立控制基质的弹性模量（模拟正常乳腺组织的<500 Pa或原发性乳腺肿瘤的~4000 Pa），而通过使用不同分子量的藻酸盐则可调控应力松弛速率（快松弛τ_1/2 ~30-150 s，慢松弛τ_1/2 ~600-1100 s）。肽缀合通过核磁共振氢谱（¹H NMR）验证。这种独立可调性为后续研究奠定了基础。

模拟rBM的改性基质可在无rBM条件下实现乳腺腺泡形态发生

在软质、快速松弛、高浓度IKVAV修饰的eBM中，MCF10A细胞在两周培养期内形成了与rBM中相似的腺泡样簇，表现出清晰的顶基极性（β₄整合素基底定位，GM130顶极定位）和高圆度。YIGSR修饰的eBM也能形成圆簇，但极化和频率稍逊。相比之下，RGD修饰的eBM中细胞仅形成小型、不规则簇，且无极化。软质、快速松弛的IKVAV eBM同样成功支持了小鼠乳腺类器官和患者来源的PDM-350类器官的生长和形态发生，证明了其作为rBM替代品的潜力。

仅肿瘤样基质刚度并不诱导侵袭表型

与以往在rBM系统中的报道不同，在快速松弛的IKVAV改性eBM中，仅增加刚度（ stiff ）并未导致MCF10A细胞侵袭性增加，细胞仍形成极性化的腺泡。这表明刚度 alone 不是诱导侵袭的充分条件。

刚性和慢应力松弛协同作用诱导IKVAV改性eBM中的侵袭

只有在刚度且慢松弛的IKVAV改性eBM中，才观察到侵袭性区域的显著出现，伴随着极性丧失、圆度下降和簇面积增加。这表明在IKVAV背景下，侵袭表型的诱导需要刚性和慢松弛力学特性的共同作用。

RGD改性基质诱导异常表型和侵袭，且与机械特性无关

在所有测试的机械条件下（无论软硬、快慢松弛），RGD改性eBM中的MCF10A细胞均未能形成腺泡，反而表现出侵袭表型，且缺乏极化。这突出了黏附肽 motif 本身对细胞命运的决定性影响。

RGD的添加不能增强IKVAV或YIGSR改性eBM中的腺泡形成

将IKVAV与RGD以不同比例混合，并未能改善腺泡的形成的效果，IKVAV单独作用已能提供最 robust 的腺泡生成信号。

MCF7细胞在改性eBM中表现出与MCF10A相似的趋势

在肿瘤性但非转移性的MCF7细胞中，观察到了与MCF10A类似的趋势：软质快速松弛IKVAV eBM支持圆簇形成，而刚度慢松弛IKVAV eBM诱导葡萄串样（侵袭性）形态；RGD eBM则普遍导致异常表型。这证明了eBM平台在不同细胞类型中的适用性。

β₄和β₁整合素的差异定位与IKVAV和RGD肽相关

在能形成腺泡的IKVAV eBM条件（软快松弛、硬快松弛、软慢松弛）中，β₁和β₄整合素均呈现基底极化。而在侵袭性的刚度慢松弛IKVAV eBM中，整合素分布紊乱。在所有RGD eBM中，整合素均呈分散分布，且β₁整合素丰度显著高于β₄。量化分析显示，IKVAV eBM中的β₄整合素强度普遍高于RGD eBM，且侵袭性条件（刚度慢松弛IKVAV）的β₄整合素强度最低。

半桥粒形成在软质、快速松弛、IKVAV改性基质中得到促进

半桥粒关键组分plectin和细胞角蛋白18（cytokeratin-18）在软快松弛、硬快松弛、软慢松弛的IKVAV eBM中基底极化，表明半桥粒形成。而在侵袭性条件（刚度慢松弛IKVAV eBM和所有RGD eBM）中，这些蛋白呈弥散分布。使用FK506抑制半桥粒形成后，在硬快松弛IKVAV eBM中诱发了侵袭表型，但在软快松弛IKVAV eBM或RGD eBM中无显著影响，证实了半桥粒在抵抗刚度诱导侵袭中的保护作用。

磷酸化FAK有助于IKVAV改性eBM中的腺泡形态发生

在所有eBM条件（包括软质eBM）中均检测到高强度的磷酸化黏着斑激酶（pFAK Y397）信号，这与通常认为pFAK仅与硬基质相关的观点不同。抑制FAK活性（使用PF-573228）破坏了软快松弛IKVAV eBM中的腺泡形成，导致圆度下降、表面粗糙度（solidity）增加以及极化丧失，表明FAK信号在腺泡形态发生中的重要作用。

IKVAV改性eBM在整个培养期内促进显著的内源性层粘连蛋白沉积

与RGD eBM相比，所有IKVAV eBM条件均诱导了显著更高的层粘连蛋白-332（LM-332）沉积，并且LM-332在腺泡样结构的基底侧富集。在软快松弛IKVAV eBM中，LM-332沉积从第1天开始并持续增加。虽然使用Exo-1抑制蛋白质分泌减少了LM-332沉积，但并未改变腺泡表型，表明IKVAV肽本身及其引发的力学环境是驱动形态发生的主要因素。

该研究得出结论，他们成功开发了一种成分明确、性质可调的3D eBM系统，能够在无rBM的条件下支持乳腺上皮细胞的腺泡形态发生和侵袭研究。该平台的关键优势在于能够独立操控基质的生化（黏附肽类型和密度）和机械（刚度、应力松弛）属性。研究发现，软质、快速松弛、IKVAV修饰的eBM能最佳地模拟rBM环境，支持正常的极性化腺泡形成。更重要的是，研究揭示了力学线索的协同效应：在IKVAV背景下，侵袭表型需要刚性和慢应力松弛的共同作用，而单一的肿瘤级别刚度并不足以诱导侵袭。这不同于在rBM系统中的既往发现，强调了独立控制力学参数的重要性。相比之下，RGD肽则不论基质力学性质如何，均倾向于诱导侵袭表型，凸显了生化信号的主导性。

机制上，研究阐明了β₁和β₄整合素信号的平衡、半桥粒的形成以及内源性层粘连蛋白（特别是LM-332）的沉积在维持腺泡表型和抑制侵袭中的核心作用。FAK信号被证明即使在软基质中也对腺泡形态发生至关重要。抑制半桥粒形成或FAK活性均可破坏正常的形态发生。

这项研究的意义重大。它不仅提供了一个可重复、无异源污染、高度可调的模块化平台，用于组织工程和疾病建模（如乳腺癌），更重要的是，它实现了对ECM机械和生化特性的解耦分析，为精确揭示它们如何独立及协同调控细胞行为（如形态发生、极化、侵袭）提供了强大的工具。这些发现深化了对乳腺上皮细胞 mechanobiology 的理解，特别是揭示了应力松弛特性这一此前在乳腺语境中未被充分重视的力学参数的关键作用。该平台有望应用于更广泛的细胞类型和生物学过程研究，推动对微环境调控细胞命运的机制探索，并具有应用于精准医疗和药物筛选的潜力。