黏细菌发育过程中细胞形态转变时的姐妹染色体分离现象及其生物学意义

本研究利用共聚焦荧光显微技术首次揭示了Myxococcus xanthus在饥饿诱导发育过程中，杆状细胞向球形孢子转变时姐妹染色体的分离现象。研究发现约40%的转化细胞(TCs)和孢子中存在分离的核体(nucleoids)，并发现了一种可能代表裂解前体的球状体(spheroplasts)亚群。这项工作为理解细菌发育过程中的染色体组织机制提供了新视角，对研究细菌细胞周期和进化适应策略具有重要意义。

　　

引言

细菌作为最小形式的细胞生命，仍然拥有复杂的细胞内组织，包括趋化受体的极性定位、蛋白振荡和核体组织。在核体组织方面，细菌染色体需要被压缩几个数量级，因为细菌染色体比微米大小的细胞长约1000倍。染色体组织通过物理和生化因素完成，如DNA超螺旋和核体相关蛋白。DNA复制后两个核体的组织促进了细胞分裂前的染色体分离。适当的染色体分离对于保持遗传物质的完整性以维持物种延续至关重要。

随着荧光显微镜和活细胞成像技术的进步，我们对核体浓缩和分离的认识有所增加。然而，大多数细菌核体研究都集中在杆状或新月形模式生物上，如Escherichia coli、Bacillus subtilis和Caulobacter crescentus。本研究研究了Myxococcus xanthus多细胞发育过程中的核体动态，这为研究杆状细胞转化为圆形孢子时的姐妹染色体分离提供了独特机会。

姐妹染色体存在于某些发育中的杆状细胞和转化细胞以及孢子中

先前的研究表明，从子实体分散的饥饿诱导孢子含有两个染色体拷贝。本研究使用荧光阻遏蛋白 operator系统和共聚焦激光扫描显微镜观察新生子实体(NFBs)内发育细胞的染色体数量和排列。研究人员构建了在33°和270°从复制起点(ori)插入tetO operator阵列的M. xanthus菌株YH3和YH4。

在浸没培养条件下饥饿后，YH3和YH4在24小时形成丘状结构，基部附近大多数细胞呈杆状。在同一NFBs中，在饥饿后30小时(PS)观察到杆状细胞和转化细胞(TCs)。到42小时，大多数细胞变成圆形孢子。在一些细胞中观察到一到两个黄绿色荧光焦点，这是由于TetR-YFP与tetO阵列的局部结合。显示两个TetR-YFP焦点的细胞证明存在两个染色体拷贝。

研究人员得出结论，姐妹染色体在发育早期存在于某些杆状细胞和TCs中，以及后期的孢子中。发育中的YH3和YH4细胞中的两个TetR-YFP焦点为研究姐妹染色体的排列提供了机会。通过检查每个菌株在不同时间PS的≥30个不同NFBs基部附近的光学切片，能够测量≥45个杆状细胞、TCs和孢子的两个TetR-YFP焦点之间的距离。

细胞检查的尺寸在两个菌株中相似。TetR-YFP焦点之间的距离与杆状细胞和TCs的长度以及孢子的直径呈正相关。考虑到细胞长度对TetR-YFP焦点之间距离的影响，数据不支持杆状细胞、TCs或孢子中两个染色体的偏向排列。有趣的是，发育细胞中焦点之间的距离小于营养生长期间分裂前细胞中的距离。

某些转化细胞和孢子中存在分离核体的证据

使用DNA结合染料DAPI观察NFBs内发育细胞的核体。研究发现DAPI阻止了M. xanthus发育，因此在不同时间PS获取了不同NFBs的图像。NFBs基部附近的光学切片显示24小时主要是杆状细胞，30小时是杆状细胞和TCs，42小时主要是孢子，与先前结果一致。

代表性细胞的放大图像显示，DNA主要占据24小时杆状细胞的中央部分，与营养生长期间DNA的定位一致，但DNA在发育杆状细胞中似乎更加浓缩，实际上核体长度占细胞长度的比例小于营养细胞。在30小时，TCs表现出一个荧光斑块的DNA、沿细胞一侧的新月形DNA或两个斑块的DNA。在42小时，孢子显示一个斑块、两个斑块或分布在整个细胞质中的DNA。

成熟孢子含有足够的DNA来填充其细胞质，但观察到一些孢子和大多数杆状细胞和TCs中的局部DNA，可能是由于DNA浓缩。正如对TetR-YFP焦点所注意到的，由于光学切片的薄度，预计不会看到所有DNA。由于整个染色体比tetO阵列大得多，预计染色体DNA荧光斑块比TetR-YFP焦点大，情况确实如此。

在一些TCs和孢子中观察到的两个DAPI染色的DNA荧光斑块似乎很好地分离，好像两个核体已经分离。为了量化分离，检查了荧光强度分布。对于30小时PS的TCs，画了一条线穿过两个斑块的明显中心并延伸到每一端的细胞膜。平均而言，DNA荧光强度在距离0.3和0.7处达到约0.7的最大值，表明两个斑块的明显中心被细胞膜之间距离的约40%分开。重要的是，DNA荧光强度在距离0.5处达到约0.5，介于最大值之间，与每一端观察到的最小值约0.4强度相似。

为了量化42小时PS孢子中DAPI染色的DNA荧光斑块的分离，需要不同的方法，因为两个斑块位于外围，并且几乎没有共定位的膜染色。因此，沿着孢子外围画了一条线，从一个斑块最接近另一个斑块的地方开始。平均而言，DNA荧光强度在距离0和0.6处达到约0.8的最大值，在最大值之间达到约0.4的最小值，表明两个斑块很好地分离。有趣的是，膜荧光强度与DNA荧光强度异相。

mNeonGreen-FruA允许观察部分转化细胞和孢子中的分离核体而不阻止发育

DAPI允许核体可视化但阻止发育。为了使用不同方法进行比较，并允许在同一NFBs的发育细胞中随时间观察核体，研究人员设计了YH6菌株，该菌株在天然染色体位点 under control of the native fruA promoter产生mNeonGreen-FruA。FruA是一种发育转录因子，已显示与MrpC协同结合许多DNA位点。

研究发现YH6发育延迟约6小时 compared to wild-type DK1622。免疫印迹分析用FruA抗体在YH6提取物中30小时PS检测到预期大小(51 kDa)的mNeonGreen-FruA蛋白，以及大小与天然FruA匹配(24.7 kDa)的较少丰富物种。次要物种可能是mNeonGreen-FruA在融合连接点附近切割的蛋白水解片段。YH6提取物中的mNeonGreen-FruA不如野生型DK1622提取物中的FruA丰富，这可能解释了YH6的发育延迟。

为了促进YH6中核体的潜在观察，将其与DK1622以约1:3的细胞比例混合。1:3的比例提供了YH6细胞之间的分离。像YH6 alone一样，1:3混合物的发育延迟了约6小时 compared to DK1622 alone，因此在PS时间比图1和2所示晚6小时成像。同一NFBs基部附近随时间的光学切片显示30小时主要是杆状细胞，36小时是杆状细胞和TCs，48小时主要是孢子，与先前结果一致，除了达到相似发育阶段晚6小时。

重要的是，mNeonGreen-FruA似乎允许核体可视化，与DNA的DAPI染色定位相似。代表性细胞的放大图像显示，mNeonGreen-FruA荧光主要占据30小时杆状细胞的中央部分。36小时的TCs表现出一个斑块、沿细胞一侧的新月形或两个斑块的mNeonGreen-FruA荧光。在48小时，孢子显示一个斑块、两个斑块或分布在整个细胞质中的mNeonGreen-FruA荧光。YH6细胞中mNeonGreen-FruA荧光的模式与DK1622细胞在相似发育阶段早6小时的DAPI荧光模式非常相似。

细胞中mNeonGreen-FruA和DAPI的荧光共定位

为了检查发育过程中同一细胞中mNeonGreen-FruA、DAPI和FM 4-64的荧光，对YH6 alone进行浸没培养发育。不同NFBs基部附近的光学切片显示30小时PS主要是杆状细胞，36小时是杆状细胞和TCs，48小时主要是孢子，与未进行DAPI染色的YH6 alone形成并在不同时间成像的NFBs结果一致。

代表性细胞的放大图像显示，DAPI和mNeonGreen-FruA荧光在30小时主要重叠在杆状细胞的中央部分。在36和48小时，DAPI和mNeonGreen-FruA荧光在模式上重叠，与分别在YH6中仅可视化mNeonGreen-FruA荧光或DK1622中在相似发育阶段早6小时仅可视化DAPI荧光时描述的TCs和孢子模式一致。mNeonGreen-FruA荧光的斑块通常似乎略大于DAPI荧光的斑块，可能是由于检测灵敏度和/或DNA结合的差异。

图4A显示了一个36小时的TC和一个48小时的孢子，其中DAPI和mNeonGreen-FruA荧光的两个斑块重叠，强烈支持两种方法都允许可视化发育细胞中分离的核体的解释。为了量化YH6 TCs和孢子中核体之间的分离，分析了DAPI和mNeonGreen-FruA荧光强度分布，如对DK1622中DAPI染色的DNA所述。对于穿过TCs中两个斑块明显中心的线，归一化的DAPI和mNeonGreen-FruA荧光强度分布相似，后者平均显示更大的最大值和更小的最小值。

对于沿着孢子外围画的线，从一个斑块最接近另一个斑块的地方开始，归一化分布相似，但在这种情况下，DAPI信号平均显示更大的最大值。两种信号都与FM 4-64染色的膜信号异相，与DK1622中DAPI和FM 4-64信号的异相性质一致。

约40%的转化细胞和孢子中可观察到分离的核体

由于FM 4-64染色所有细胞的膜，这些细胞以各种方向堆积在NFBs内，在单个光学切片(0.5 μm)中确定某些单个细胞的形状具有挑战性。此外，尽管DAPI染色或mNeonGreen-FruA结合的核体比TetR-YFP焦点大，但由于光学切片的薄度，核体可能被遗漏，因此希望收集光学切片的z-stacks以增强核体量化。

因此，修改了YH6，使其在vanillate诱导型 promoter控制下异位产生tdTomato， resulting in strain YH9。推断tdTomato的红色荧光将分布在整个细胞的细胞质中，并在大多数情况下允许确定它们的形状，而mNeonGreen-FruA将允许可视化同一细胞中的大多数核体。研究发现YH9发育延迟约6小时 compared to DK1622，正如预期 since YH6 was similarly delayed。

以1:3的比例混合YH9和DK1622细胞以提供YH9细胞之间的分离，发育延迟了约6小时，如YH6和DK1622的1:3混合物所见，因此在PS相同时间成像。同一NFBs基部附近随时间的光学切片显示30小时主要是杆状细胞，36小时是杆状细胞和TCs，48小时主要是孢子。在36和48小时，收集了从NFBs基部附近到向上5 μm的光学切片的z-stacks。向上超过5 μm的光学切片分辨率降低。

将每个z-stack投影到与z轴正交的平面上以创建最大强度投影。只有沿z轴具有最大强度的体素被投影到平面上，导致z-stack的部分二维表示。忽略了与其他细胞重叠的细胞。在剩余的细胞中，代表性细胞的放大图像显示，36小时PS的TCs表现出一个斑块、沿细胞一侧的新月形或两个斑块的mNeonGreen-FruA荧光，与YH6观察到的结果一致。

在48小时，孢子显示两个斑块或分布在整个细胞质中的mNeonGreen-FruA荧光。未观察到具有一个斑块mNeonGreen-FruA荧光的孢子，与YH6的结果相反。然而，只检查了YH6的一个光学切片，因此可能由于光学切片的薄度而错过了看到第二个斑块。可以想象，如果分离的核体良好分离，如数据所示，在z-stack的最大强度投影中可能很少遗漏第二个斑块。

因此，确定了在36和48小时分别五个NFBs的最大强度投影中具有两个mNeonGreen-FruA荧光斑块的TCs和孢子的比例。对于TCs和孢子，约40%的细胞表现出两个斑块，平均值在数据的不确定性范围内。得出结论，在约40%的TCs和孢子中可观察到分离的核体。大多数TCs沿一侧有新月形核体，大多数孢子有分布在整个细胞质中的mNeonGreen-FruA荧光。

甘油诱导孢子形成期间约10%-20%的转化细胞和孢子中可观察到分离的核体

M. xanthus不仅可以在饥饿期间在子实体中形成孢子，还可以在没有饥饿或子实体形成的情况下，当生长期细胞用某些化学物质(包括甘油)处理时形成孢子。先前对甘油诱导孢子的研究表明，它们的染色体拷贝数从一个到两个甚至更多不等。

为了检查单细胞甘油诱导孢子形成过程中的核体定位，用DAPI和FM 4-64染色DK1622以分别可视化DNA和细胞膜。由于在单层中可视化细胞(而不是堆积在NFBs内)，收集了从单层细胞正下方到向上5 μm(即远高于细胞)的光学切片的z-stacks，并如前所述创建最大强度投影。

正如预期，DNA主要占据生长杆状细胞的中央部分。在添加甘油后1和3小时分别观察到主要是TCs和孢子，两者都表现出一个斑块或两个斑块的DAPI染色DNA。未观察到任何具有超过两个斑块的细胞。与在NFBs内DAPI染色的DNA的观察相反，未观察到甘油诱导的TCs含有沿一侧的新月形核体或具有去浓缩核体的孢子。

量化了在1和3小时分别具有两个DAPI染色DNA斑块的TCs和孢子的比例，分别约为20%和15%，但两个平均值都在数据的不确定性范围内。得出结论，在甘油诱导孢子形成期间，约15%-20%的TCs和孢子中可观察到具有DAPI染色DNA的分离核体。

研究发现，在存在vanillate诱导tdTomato的YH9生长中，在添加甘油后3小时表达mNeonGreen-FruA，因此在该时间可视化细胞并收集z-stacks，然后如前所述创建最大强度投影。tdTomato的红色荧光显示TCs和孢子，代表性细胞的放大图像显示两者都表现出一个斑块或两个斑块的mNeonGreen-FruA荧光。未观察到任何具有超过两个斑块的细胞。

与甘油诱导的TCs和孢子中DAPI染色DNA的观察一致，未观察到含有沿一侧的新月形核体的TCs或具有完全去浓缩核体的孢子。然而，注意到在添加甘油后约3小时表达mNeonGreen-FruA的YH9中核体似乎不如在添加甘油后1或3小时用DAPI染色的DK1622中浓缩。一个可能的解释是，向DK1622添加DAPI阻止了在YH9中样品制备和z-stack收集期间持续约15-30分钟的去浓缩过程。

量化了具有两个mNeonGreen-FruA荧光斑块的TCs和孢子的比例，分别约为10%和15%，但两个平均值都在数据的不确定性范围内。这些结果与DNA的DAPI染色相似，支持结论，在甘油诱导孢子形成期间，约10%-20%的TCs和孢子中可观察到分离的核体。

讨论

细胞形状变化过程中染色体分离的潜在机制

理解发育过程中核体分离的机制可以允许其操作和确定其对发育进展的重要性。M. xanthus在生长细胞中使用parABS系统进行染色体分离。基于对分配细菌染色体或质粒的parABS系统的大量工作，ParB/parS复合物与非特异性结合核体DNA的ParA-ATP二聚体结合，刺激ParA ATPase活性并从核体和ParB/parS释放ParA-ADP。这被提议创建核体结合的ParA-ATP二聚体的梯度，通过扩散、捕获和释放的循环移动ParB/parS复合物朝向细胞极。

M. xanthus发育过程中的染色体分离很可能由其parABS系统介导。为了检验这一假设，需要条件突变菌株，因为ParA和ParB对细胞活力是必需的。已经描述了在vanillate诱导型 promoter控制下产生ParB的工程菌株，可以在发育开始时或更接近杆状细胞开始转变为孢子的时间进行vanillate withdrawal，取决于ParB耗竭的动力学。这可能允许操作核体分离并确定其对TCs和孢子形成的影响。

最近已经确定了几个在生长过程中对染色体分离具有重要作用的多蛋白系统。BacNOP/PadC支架帮助定位ParB/parS复合物和ParA，并与染色体结构维持复合物具有不同但冗余的作用。我们的研究提出了这些多蛋白系统在发育细胞形状变化过程中核体分离的可能功能的问题。M. xanthus基因组还编码三个ParA样蛋白，但据我们所知，它们在生长或发育过程中染色体分离的潜在功能尚未被研究。

我们的一些结果表明姐妹染色体分离的机制在发育和生长细胞中可能不同。未在发育杆状细胞、TCs或孢子中检测到偏向染色体排列，而生长期间的分裂前细胞显示高度偏向的ori-ter-ter-ori姐妹染色体排列。分裂前细胞长约6-8 μm，在33°或270°从ori定位的tetO阵列导致TetR-YFP焦点相距约3-4 μm。发育杆状细胞长约6 μm，在相同位置定位的tetO阵列导致TetR-YFP焦点相距约0.75 μm。如果姐妹染色体排列为ori-ter-ter-ori，如分裂前细胞，TetR-YFP焦点将相距约3 μm。超过2 μm的差异支持发育杆状细胞中不同的染色体排列。

有趣的是，TCs既未显示偏向染色体排列，也未显示TetR-YFP焦点之间距离的显著差异 compared to发育杆状细胞。后一观察令人惊讶，因为约40%的TCs具有分离的核体，并且大多数其他饥饿诱导的TCs沿一侧有新月形核体。也许检查的两个染色体位点没有像通过DAPI染色和mNeonGreen-FruA结合可见的核体其他部分那样分离。测试染色体其他地方定位的tetO阵列(例如 near ter at 192° from ori)和ParB-YFP结合到ori附近的parS，并将这些方法与DAPI染色相结合，可能有助于解决关于TCs中姐妹染色体排列的剩余问题。

饥饿诱导的TCs中沿一侧的新月形核体，但甘油诱导的TCs中没有，是 intriguing。最近一份报告强调了转ertion(膜蛋白的耦合转录、翻译和插入)在快速生长E. coli内核体靠近内膜定位的重要性。转ertion可能有助于饥饿诱导M. xanthus TCs中新月形核体的定位。特别是，参与肽聚糖重塑的酶的合成，伴随着TCs中持续的形状变化，可能促进核体定位到内膜。

甘油诱导的TCs中缺乏新月形核体表明其他因素控制核体形状。例如，甘油诱导的快速细胞形状变化可能由于失去限制和改变的分子拥挤而导致核体扩张。孢子直径仅约2 μm，因此实验中可能无法检测到偏向染色体排列。Tzeng和Singer报告了成熟(5天老)孢子中姐妹染色体的ori和ter区域都定位到孢子外围，通常相距约180°，但sdeK位点定位到孢子内部。在我们的实验中，在33°或270°从ori定位的tetO阵列通常定位到42小时PS孢子的外围，但不相距2 μm；而是平均相距约0.75 μm，与发育杆状细胞和TCs相似。

姐妹染色体位点之间的距离是否随着杆状细胞转变为孢子而变化，以及关于细胞形状变化过程中染色体分离机制的其他重要问题，最好通过跟踪单个细胞中的染色体动态来解决。然而，通过制作饥饿诱导NFBs的延时电影来确定TCs的命运具有挑战性。尽管TCs不能运动，许多在12小时成像期间离开了焦平面，可能是由于裂解或运动(由形状变化和/或其他TCs或杆状细胞的运动驱动)。快速、单细胞的甘油诱导孢子形成过程可能更适合跟踪发育细胞中的染色体动态。两种发育过程共享许多特征。一个区别是甘油诱导孢子的染色体拷贝数更多变，具有几乎相等比例的一个或两个拷贝。添加甘油后DNA复制和细胞形状变化之间较弱的耦合可能解释了我们观察到的具有分离核体的TCs和孢子比例约低两倍 compared to饥饿诱导发育。对于在甘油诱导孢子形成期间具有两个染色体拷贝的细胞，姐妹染色体的分离是否同样有效并采用与饥饿诱导发育相似的机制仍有待观察。

核体分离作为bet-hedging策略或进化残余

区室化事件通常伴随染色体分离。在细菌生长期间，染色体浓缩和分离先于细胞分裂，因此后代细胞各接收一个染色体拷贝。在B. subtilis内孢子形成期间，染色体跨不对称定位的分裂隔膜易位将一个染色体拷贝分配给前孢子，而另一个拷贝保留在母细胞中。然而，我们发现核体分离发生在没有区室化的情况下 during M. xanthus发育。

一个可能的解释是，核体分离是一种bet-hedging策略，以促进孢子萌发后的快速细胞分裂，如果营养在孢子成熟之前变得可用。根据这一假设，具有分离核体的新形成孢子在萌发后将准备进行细胞分裂，在经常波动营养供应的环境中获得生长优势。另一方面，由于核体分离需要资源，也许它不会发生在某些TCs和孢子中，增强孢子在易于 prolonged starvation的环境中的存活，因此 hedging bets。

在先前的研究中，向饥饿细胞添加营养为大约细胞形状变化开始时的孢子形成承诺提供了证据。其中一项研究表明，一些新形成孢子在响应营养时萌发。确定具有分离与非分离核体的新形成孢子在孢子萌发后细胞分裂的步伐是否不同，需要跟踪单个细胞的染色体动态和随后的分裂。比较新形成与成熟孢子目前更易处理。我们的结果表明，随着孢子成熟，它们的核体去浓缩。到48小时PS，大多数孢子的核体似乎已经去浓缩，到72小时未观察到核体定位。也许孢子的静止状态使得难以维持核体浓缩和分离。成熟孢子和新形成孢子在萌发后细胞分裂发生的时间上是否不同可以进行研究。这以及许多其他问题需要回答以确定我们观察到的核体表型异质性是否符合bet hedging的正式定义。

或者，M. xanthus发育过程中的核体分离可能是祖先事件的进化残余，这些事件包括细胞分裂以产生具有一个染色体拷贝的孢子。据我们所知，除M. xanthus之外的其他黏细菌孢子的染色体拷贝数尚未确定。在整个广泛的黏细菌系统发育树中系统确定孢子染色体拷贝数可以检验进化残余假设。进化具有两个染色体拷贝的孢子的驱动力可能是增加存活和在土壤环境中萌发的能力，导致祖先细胞分裂的丧失。

发育早期存在的圆形细胞可能是注定裂解的球状体

我们的几个实验揭示了一个圆形细胞亚群，它们与TCs和孢子不同。在我们的浸没培养发育条件下，丘状结构在约18小时PS形成，到此时，剩余的杆状细胞数量仅为初始数量的约30%(即70%经历了裂解)。尽管许多细胞经历裂解，它们可能不会作为圆形细胞持续很长时间。圆形细胞不太可能是孢子前体，因为直到27小时才检测到超声抗性孢子，然而我们在18小时观察到圆形细胞。此外，我们已经表明TCs是椭圆形的，不是圆形的，并且TCs和孢子在表现TetR-YFP和mNeonGreen-FruA荧光的能力方面与圆形细胞亚群不同。圆形细胞亚群缺乏荧光表明它们无法维持水平或适当折叠的荧光蛋白。圆形细胞也未表现DNA定位，如大多数杆状细胞和TCs以及许多孢子所做。圆形细胞中缺乏DNA定位表明无法维持DNA浓缩和/或完整性。总之，发育早期存在的圆形细胞的特征表明它们是注定裂解的球状体。

我们观察到的圆形细胞亚群小于先前发育中M. xanthus研究中报告的"死"细胞比例。先前的研究使用LIVE/DEAD BacLight epifluorescence染色方法，并显示在24小时PS或18小时存在的约50%细胞用碘化丙啶(红色)染色。这些细胞通常被分类为"死"，但更准确地描述为具有受损的细胞包膜，因此可能正在死亡或已死。在任何情况下，我们在24小时或30小时观察到<50%圆形细胞，因此与先前研究一起，我们的发现表明圆形细胞与具有受损细胞包膜的发育细胞相比寿命短。

我们提出，碘化丙啶染色检测到杆状细胞和可能TCs在死亡过程的早期阶段，而圆形细胞是死亡过程后期阶段的球状体，即将经历裂解。这可以通过比较碘化丙啶染色与本文描述的几种菌株(YH5、YH6或YH7)中任何之一的荧光来检查，这些菌株允许识别圆形细胞。我们的假设预测，更多发育早期的细胞会用碘化丙啶染色，而不是在平行实验中表现指示圆形细胞的荧光(即由于FM 4-64膜染色的圆形红色荧光且无细胞质荧光)。

结论

我们发现，在M. xanthus的饥饿和甘油诱导发育过程中，当杆状细胞转变为圆形孢子时，姐妹染色体经常分离。用DNA结合染料DAPI染色细胞或产生DNA结合转录因子mNeonGreen-FruA显示，在饥饿诱导NFBs中约40%的TCs和孢子中存在两个良好分离的荧光斑块。大多数其他TCs沿一侧有新月形核体，可能指示正在进行的分离。大多数孢子中的核体似乎已经去浓缩。在快速单细胞甘油诱导孢子形成过程中，只有约10%-20%的TCs和孢子表现分离的核体。我们讨论了发育核体分离的潜在机制和可能的原因。我们还讨论了有趣的可能性，即我们在几个实验中发育早期观察到的圆形细胞亚群可能识别处于死亡过程后期阶段的球状体，该过程以裂解结束。