皮肤定植特定贪婪丙酸杆菌分支作为假体周围感染风险因素的多中心研究

本研究通过多中心比较分析揭示，贪婪丙酸杆菌（Cutibacterium avidum）所有假体周围感染（PJI）分离株均属于系统发育分支1（Clade 1），虽未发现特异性毒力基因，但均呈现强生物膜（biofilm）形成能力且对利福平（rifampin）敏感。值得注意的是，PJI分离株表现出适应性降低的细菌适合度（bacterial fitness），这可能是其导致慢性感染的潜在机制。

　　

ABSTRACT

贪婪丙酸杆菌（Cutibacterium avidum）日益被认为是假体周围感染（PJIs）的病原体，然而关于其致病潜力以及与共生菌株区别特征的数据仍然有限。在这项多中心研究中，我们比较了来自四家欧洲医院的11株PJI分离株和32株健康皮肤分离株。我们研究了系统发育关系、抗生素敏感性、生物膜形成和细菌适合度。系统发育基因组分析揭示了C. avidum群体内的两个主要分支。所有PJI分离株都 exclusively 属于分支1（Clade 1），该分支也包含皮肤分离株。在分支1内，基因含量分析显示PJI和皮肤分离株之间没有一致的遗传差异。所有分离株都表现出中度至强生物膜形成能力，在两个数据集中均无显著差异。最小抑菌浓度（MIC）和最小生物膜抑制浓度（MBIC）值较低且基本一致，而除利福平外，所有抗生素的最小生物膜根除浓度（MBEC）值均升高。一株分离株因携带erm(X)基因而对克林霉素耐药。利福平 consistently 显示出最低的MIC、最小杀菌浓度（MBC）、MBIC和MBEC值。通过细菌定量适合度分析（BaQFA）评估的细菌适合度，当分析所有菌株时，PJI分离株显著低于皮肤分离株（P = 0.039），但当仅限于分支1时，这种差异无统计学意义。总之，C. avidum分离株无论临床来源如何，都是强生物膜生产者。PJI分离株仅限于一个单一的系统发育分支，但在该分支内缺乏独特的生物膜或适合度特征，这表明多个分支1菌株可能具有引起PJIs的潜力。

IMPORTANCE

贪婪丙酸杆菌长期以来被认为是皮肤共生菌，但它越来越多地与假体关节感染（PJIs）相关。尽管其临床意义日益凸显，但对其毒力潜力或侵袭性菌株如何区别于共生菌株知之甚少。这项多中心研究提供了迄今为止最全面的比较分析，整合了来自PJI相关和皮肤来源分离株的表型和基因组数据。我们表明所有分离株都是强生物膜形成者，并且侵袭性分离株表现出降低的生长适合度——这种表型与其他病原体的持续存在和治疗失败有关。值得注意的是，所有PJI分离株都属于一个单一的系统发育分支，表明C. avidum的特定谱系可能更易引起感染。这些发现有助于阐明这种新兴病原体的生物学特性，并为改进诊断、药敏试验以及未来的感染预防和治疗策略奠定基础。

INTRODUCTION

关节成形术相关的感染导致高发病率，同时也增加了医疗系统的成本。从假体关节感染（PJIs）中分离出的最常见细菌是葡萄球菌，其次是链球菌、肠球菌、革兰氏阴性杆菌和厌氧菌。尽管厌氧菌仅占PJI的约3–6%，但它们可导致肩关节植入物中超过50%的感染。其中，超过70%是革兰氏阳性细菌，属于Cutibacterium spp.，其中Cutibacterium acnes占据了主要关注点。然而，该属的另一个物种，Cutibacterium avidum，也日益重要。

C. avidum是人类皮肤微生物群的成员。它倾向于居住在潮湿区域，如腋窝、鼻孔、腹股沟和直肠。它被认为是一种低毒力潜力的皮肤共生菌；然而，它可以在浅表和深部/侵袭性感染中作为机会性病原体，如皮肤脓肿、腹部感染、乳房感染、感染性心内膜炎、前列腺感染以及骨和关节感染。C. avidum是PJI的一种不常见病原体，主要见于晚期慢性感染。它优先定植潮湿区域；因此，发现主要受影响的是接受初次髋关节成形术的肥胖个体。

许多不同的毒力因子可能参与PJI，包括生物膜形成。然而，目前关于C. avidum生物膜在PJI中作用的信息非常有限。因此，我们研究了从PJI患者深部组织回收的C. avidum分离株的抗生素敏感性和毒力特性，如生物膜形成和适合度，并将其与健康皮肤分离株进行比较。我们进行了核心基因组全基因组序列分析，以检查队列间的系统发育关系。

MATERIALS AND METHODS

Strain isolation and identification

该研究包括43株C. avidum分离株，这些分离株要么是从四家欧洲医院的PJI中回收的（n = 11），作为由欧洲临床微生物学和传染病学会欧洲植入物相关感染研究组支持的多中心研究的一部分，要么是从健康皮肤（HS）志愿者（n = 32）通过用无菌刀片刮擦皮肤获得的。皮肤刮屑从刀片上取下并转移到ESwab培养拭子中。拭子在Schaedler-5%绵羊血琼脂平板上培养48小时，37°C厌氧条件，分离株通过MALDI-TOF MS鉴定。PJI回收的C. avidum分离株的临床数据如表S1所示。

Biofilm formation

所有PJI和皮肤分离株的生物膜形成使用Stepanovi?等人的改良方法作为静态生物膜测定进行评估。简而言之，使用含有2%葡萄糖的脑心浸液（BHI）肉汤，细菌接种量为10⁷ CFU/mL，在96孔板中于37°C厌氧条件下培养。孵育72小时后，移除BHI肉汤，孔用甲醇冲洗两次，并用结晶紫染色。使用酶标仪在570 nm测量每个孔的光密度（OD）。每个分离株测试三次。根据OD值和设定的 cutoff 值（ODc），将分离株分为不同类别。结果解释为：无生物膜生产者（OD ≤ ODc），弱生物膜生产者（ODc < OD ≤ 2 × ODc），中度生物膜生产者（2 × ODc < OD ≤ 4 × ODc），或强生物膜生产者（4 × ODc < OD）。

Susceptibility testing

对11株引起PJI的C. avidum分离株进行了抗生素敏感性测试。测试的抗生素包括阿莫西林-克拉维酸、克林霉素、左氧氟沙星、利奈唑胺、青霉素、利福平和万古霉素。根据欧洲抗菌药物敏感性试验委员会（EUCAST）的方案，采用肉汤微量稀释法测定最小抑菌浓度（MIC）和最小杀菌浓度（MBC）。将分离株的菌落悬浮在Mueller Hinton阳离子调节肉汤中。将100 μL含有抗菌剂的Mueller-Hinton阳离子调节肉汤加100 μL细菌悬浮液接种到无菌圆底96孔板中，以获得10⁴ CFU/孔的最终接种量，并在厌氧条件下孵育。孵育48小时后，测定MIC（无浊度的第一个抗生素浓度）。随后，使用改良的flash microbiocide方法，将每孔50 μL转移到一个含有150 μL Mueller Hinton阳离子调节肉汤的新板中。板在37°C厌氧条件下孵育2天，测定MBC（无细菌生长的第一个抗生素浓度）。

最小生物膜抑制浓度（MBIC）和最小生物膜根除浓度（MBEC）按照Coenye等人先前描述的方案进行评估。简而言之，将分离株的菌落转移到无菌磷酸盐缓冲盐水（PBS）中，并将上清液调整至0.5 ± 0.02 McFarland浊度。将200 μL细菌悬浮液转移至无菌、平底、聚苯乙烯96孔组织培养板的每个孔中。将板放入厌氧罐中，以允许细菌粘附到孔底。粘附4小时后，小心移除含有浮游细菌的上清液。每孔用200 μL无菌PBS洗涤以去除未粘附的细胞。然后，加入200 μL梭菌营养培养基，将板在37°C厌氧条件下孵育24小时，以允许生物膜成熟。孵育后，再次移除上清液，并用200 μL无菌PBS洗涤板。然后每孔加入100 μL梭菌营养培养基加100 μL含有抗生素系列稀释液的梭菌营养培养基，并进一步孵育。在厌氧条件下孵育48小时后，测定MBIC（无浊度的第一个抗生素浓度）。MBIC评估后，用200 μL无菌PBS洗涤孔，每孔加入200 μL新鲜梭菌营养培养基。通过剧烈刮擦孔底并使用无菌移液器吸头进行均质化，机械破坏生物膜。孵育48小时后测定MBEC（无细菌生长的第一个抗生素浓度）。

使用EUCAST针对C. acnes的耐药折点来解释抗菌药物敏感性结果。左氧氟沙星和利福平的折点尚未确定用于厌氧革兰氏阳性菌。

使用GraphPad Prism 8.4.3进行统计分析。使用Wilcoxon非参数检验比较两组数据。统计学显著性设定为P值≤ 0.05。图3使用R生成。

Bacterial quantitative fitness analysis (BaQFA)

为了评估C. avidum分离株间的繁殖适合度差异，使用了BaQFA方法。该方法涉及将96个细菌培养物点样在琼脂平板上，并通过使用Arduino平台的BaQFA机器人进行延时摄影，随时间捕获它们的生长。

测试了11株从PJI回收的侵袭性分离株和31株浅表皮肤分离株，以一株浅表皮肤菌株作为参考菌株来分析适合度差异。所有BaQFA实验使用C. avidum菌株PAVI-2017310081作为参考菌株。将C. avidum分离株在哥伦比亚绵羊血琼脂平板上划线，并在37°C厌氧条件下培养3天。从琼脂平板上刮取新鲜细菌菌落，并在PBS中稀释至OD_600nm为0.10 (±0.01)。将细菌溶液在PBS中1:10稀释，并将3 μL点样到含有20 mL琼脂培养基的矩形单孔BHI琼脂板上，呈网格图案（每个测试菌株与竞争的参考菌株直接相邻生长）。将琼脂板转移到BaQFA装置中，并在37°C厌氧条件下孵育。进行自动图像捕获（每30分钟一次）。

使用BaColonyzer软件分析这些图像，以提取每个菌落随时间的生长情况，获得详细的生长曲线。然后，如先前所述，从拟合这些曲线的Gompertz生长模型的参数中得出适合度。考虑到实验运行中固有的变异性，每次运行包含同一菌株比较的96个培养点样被视为一个单独的研究，具有潜在的随机适合度估计差异。因此，使用随机效应模型的荟萃分析来计算和绘制相对适合度估计值及其置信区间，从而全面评估与参考菌株（PAVI-2017310081）在成对比较中的菌株特异性适合度差异。

Genomic analyses

DNA isolation and genome sequencing

对于基因组DNA提取，使用Master Pure Gram-Positive DNA Purification Kit，按照制造商的说明进行。首先使用NanoDrop ND-1000检查分离DNA的浓度和纯度；使用Qubit dsDNA HS Assay Kit按照制造商的建议测定浓度。使用Nextera XT DNA Sample Preparation Kit制备Illumina鸟枪法文库，随后使用v3试剂盒在MiSeq系统上进行测序，循环数为600次，按照制造商的建议进行。使用Trimmomatic版本0.36进行质量过滤。使用SPAdes基因组组装软件版本3.13.0进行组装。使用Qualimap版本2.2.1验证组装并确定序列覆盖率。所有基因组序列已存入GenBank，登录号列于表S2。

Bioinformatics tools and analyses

对于系统发育基因组分析，使用Harvest软件包中的Parsnp程序识别和比对核心基因组。Parsnp鉴定的可靠核心基因组SNP用于重建全基因组系统发育。使用Interactive Tree Of Life可视化系统发育树。使用ResFinder鉴定介导抗菌药物耐药性的（获得性）基因。

使用Proteinortho通过双向blast方法鉴定分支内和分支间特异性基因含量。使用以下blast设置识别直系同源蛋白：覆盖率 > 50% 且同一性 > 50%。使用以下基因组来识别分支1与分支2特异性基因含量差异：CI828_clade 1; CI878_clade1; CI882_clade1; PAVI-2017310081_clade1; PAVI-2017310082_clade1; PAVI-2017310120_clade1; HS4_clade2; HS7_clade2; HS9_clade2; PAVI-2017310084_clade2; PAVI-2017310145_clade2; 和 PAVI-2017310195_clade2。为了识别分支1内皮肤分离株和PJI分离株之间的潜在差异，比较了以下基因组：CI828_clade 1_PJI; CI878_clade1_PJI; CI882_clade1_ PJI; PAVI-2017310081_clade1_healthy skin; PAVI-2017310082_clade1_healthy skin; 和 PAVI-2017310120_clade1_healthy skin。使用BV-BRC和KEGG工具BlastKOALA进行注释。

RESULTS

Genomic analysis

对11株PJI分离株和32株HS分离株进行了测序。分离株的基因组大小范围从2,471到2,728 kb，最大相差257 kb。注释预测的编码序列（CDS）范围从2,362到2,654，最大相差292个CDS。接下来进行了核心基因组比较。在C. avidum群体中检测到两个主要的系统发育分支（分支1和分支2）。有趣的是，所有PJI分离株都属于同一个分支（分支1）。该分支还包含来自其他PJI病例的分离株，包括分离株T13, T14, 和 T15 以及 FMS2275 和 FMS4815，以及与其它疾病相关的分离株，如从根治性前列腺切除术标本中分离的菌株TM16。相反，HS分离株可以在两个分支中找到，分支1和分支2。我们注意到分支2分离株（n = 6）的基因组平均比分支1分离株（n = 37）的基因组大129 kb。在分支1内，皮肤分离株（n = 26）的基因组平均比PJI分离株（n = 11）的基因组大42 kb。我们搜索了分支1内皮肤分离株和PJI分离株之间一致的基因含量差异；只发现很少的CDS或CDS片段存在差异。接下来，我们搜索了分支1和分支2分离株之间一致的基因含量差异。在这里，分别发现209和272个CDS（或CDS片段）是分支1或分支2特异性的。

Biofilm

我们比较了11株从PJI回收的分离株和32株来自HS的分离株的生物膜形成。两组之间未发现统计学显著差异。此外，在针对分支1进行的亚分析中，HS组和PJI组之间的差异也不显著。根据所使用的静态生物膜测定方法，所有分离株都是生物膜生产者。在两组中，大多数分离株是强生物膜生产者（皮肤组93.7%；PJI组72.7%），其余分离株是中度生物膜生产者。两组中强和中度生物膜生产者的比例未发现统计学显著差异（P值0.27）。

Antibiotic susceptibility

来自PJIs的C. avidum分离株对大多数测试抗生素显示出普遍较低的MIC值。对于大多数药物，MIC和MBIC分布几乎相同，MBIC在一些分离株中略高，表明有限的生物膜耐受性。利福平对浮游和生物膜嵌入细胞显示出最有效的活性，所有分离株的MIC、MBC和MBIC值均≤0.125 mg/L。值得注意的是，利福平的MBEC值仍然很低，大多数分离株在≤0.5 mg/L时被根除，与其他药物形成鲜明对比。对于青霉素和左氧氟沙星，MBC和MBEC值显著高于MIC/MBIC，表明杀菌效果有限且生物膜根除效果差。阿莫西林-克拉维酸、利奈唑胺、万古霉素和克林霉素表现出良好的MIC和MBC谱；然而，在大多数情况下，MBEC值 >32 mg/L，表明在根除成熟生物膜方面效果降低。一株分离株（HOL 4）表现出克林霉素升高的MIC、MBC、MBIC和MBEC值，与存在erm(X)耐药基因一致。总体而言，利福平是唯一 consistently 表现出低MIC、MBC、MBIC和MBEC值的抗生素，突出了其对浮游和生物膜状态下的C. avidum的卓越活性。

BaQFA

由于细菌的繁殖适合度在抗菌药物耐药性进化以及持久性中起着重要作用，而持久性与慢性感染有关，我们定量评估了细菌分离株间的适合度差异。为此，我们使用了BaQFA方法，该方法允许我们定义两个给定分离株之间的相对竞争适合度（RCF）。我们选择评估所有分离株与随机选择的一株HS参考分离株相比的RCF。当包括所有菌株（分支1和分支2菌株）时，我们检测到HS分离株的RCF显著高于引起PJI的分离株（P值0.039）。然而，当分析仅限于分支1分离株时（包含PJI和HS分离株的分支），这种差异不再达到统计学显著性，尽管观察到类似的趋势（P = 0.054）。皮肤来源组内的RCF值明显异质。在排除分支1子集内的离群分离株后，PJI和皮肤分离株之间的RCF差异进一步减小，并且无统计学显著性（P = 0.099）。为了探索细菌适合度中潜在的分支特异性差异，我们比较了属于分支1和分支2的C. avidum分离株的RCF。未观察到分支1和分支2分离株之间的RCF存在显著差异（中位RCF：分支1 = X，分支2 = Y；P = 0.8903）。

DISCUSSION

据我们所知，这是对来自PJIs和HS的C. avidum分离株进行的最全面的比较研究，整合了系统发育、生物膜形成、抗生素敏感性和细菌适合度的分析。

系统发育基因组分析揭示了两个不同的系统发育分支，分支1和分支2，这可能代表了C. avidum的亚种。值得注意的是，所有PJI分离株都 exclusively 属于分支1，而皮肤分离株分布在两个分支中。这表明只有分支1分离株具有引起植入物相关感染的潜力。

分支1和分支2分离株之间的基因含量比较揭示了209和272个分支特异性基因。大多数基因无法进行功能注释。分支1特异性功能主要与信号传导和运输过程相关。相反，分支2分离株含有能够进行碳水化合物代谢（例如，山梨醇、半乳糖醇和肌醇）和通过II型脂肪酸合成（FASII）途径进行de novo脂肪酸生物合成的基因，这些在分支1中不存在。这些代谢差异可能反映了生态位特异性适应，表明分支2菌株更擅长在营养有限的环境中生存，而分支1菌株可能更依赖于宿主衍生的营养素，如脂肪酸。

我们研究中的所有C. avidum分离株都表现出强生物膜形成能力，无论临床来源或分支归属如何。这与先前在C. acnes中的发现形成对比，后者大多数分离株仅形成中度或弱生物膜。在C. avidum中观察到的强生物膜表型可能与物种特异性的胞外多糖样结构有关，该结构在其他Cutibacterium物种中不存在，并可能促进表面粘附和抗生素耐受。

我们研究中观察到的MIC值与先前数据一致，并且与骨科植入物相关感染中报告的C. acnes的MIC值相当。一株分离株（HOL 4）表现出高克林霉素MIC，与erm(X)基因相关，这是Cutibacterium spp中已知的耐药决定簇。重要的是，没有针对C. avidum的物种特异性EUCAST或CLSI临床折点，因此我们描述性地呈现我们的MIC数据，而不将分离株分类为“敏感”或“耐药”。利福平显示出最低的MIC、MBC、MBIC和MBEC值，表明对浮游和生物膜相关细菌具有高的in vitro活性。然而，利福平的临床疗效仍有争议，其使用应仔细权衡不良反应风险以及缺乏来自良好对照研究的明确证据。

使用BaQFA，我们发现PJI分离株与共生皮肤分离株相比，显示出降低的相对竞争适合度，当考虑所有分离株时（分支1和分支2）。仅限于分支1的适合度亚分析显示，PJI和皮肤分离株之间的差异不再具有统计学显著性（P = 0.053），尽管趋势持续存在。鉴于细菌适合度在持久性和抗菌药物耐受中的已知作用，这可能代表了一种有利于慢性感染的适应性表型。降低的适合度与更休眠、缓慢生长的状态一致，可能类似于细菌持久菌。已知这种状态会降低对抗生素和免疫清除的敏感性，从而促进慢性感染。我们的发现支持这样的观点，即生物膜相关的持久性可能不仅由细胞外基质保护驱动，还由细菌生长动态和代谢活动的转变驱动。降低的RCF是C. avidum中生物膜形成的原因还是结果尚不清楚。一种假设是，有利于侵袭性的适应可能涉及增殖能力的权衡。或者，降低的生长本身可能促进在假体关节微环境恶劣条件下的生物膜形成和持久性。

这项研究的一个主要限制是缺乏针对C. avidum的物种特异性临床折点。我们的解释依赖于描述性MIC值，不能直接为治疗决策提供信息。此外，用于药敏试验的肉汤微量稀释法虽然是标准方法，但可能低估某些药物如阿莫西林-克拉维酸的MIC，正如EUCAST针对C. acnes所指出的那样。此外，虽然我们的分离株集代表了迄今为止研究的最大队列，但样本量仍然相对较小，限制了统计功效和普遍性。

总之，来自PJIs和HS的C. avidum分离株无论临床来源如何，都表现出强的in vitro生物膜形成。所有PJI分离株都属于分支1，表明该分支具有致病潜力。虽然抗生素耐药性罕见，但生物膜相关的持久性和降低的细菌适合度可能有助于治疗挑战。我们的发现强调需要物种特异性临床折点、对系统发育分支更好的功能理解以及进一步研究C. avidum相关感染中生物膜驱动的表型。

ACKNOWLEDGMENTS

作者感谢ESGIAI小组对Cutibacterium感染的研究。我们感谢Jared Liu将苏黎世C. avidum分离株的基因组序列提交到GenBank。我们感谢Francisco J. Pardo-Palacios设计图表。

这项工作由Swiss Life Jubil?umsstiftung (Y.A.), 赠款CIBERINFEC-CIBER de Enfermedades Infecciosas CB21/13/00043 (J.E.) 和 “Fabrikant Vilhelm Pedersen og Hustrus Legat” (由Novo Nordisk Foundation推荐) (no. 30658) (H.B.) 资助。