分子异种监测技术揭示孟加拉国达卡登革热疫情中的登革病毒血清2型传播动态

本文推荐一项基于分子异种监测（MX）的创新研究，该研究在孟加拉国达卡市利用现场采集的埃及伊蚊（Ae. aegypti）成功检测到登革病毒血清2型（DENV-2）。研究通过实时逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）技术，首次在当地蚊媒中证实病毒存在，感染率估计为0.45–0.51%，为资源有限地区提供了可持续、低成本的疫情预警新策略，对登革热防控具有重要实践意义。

　　

ABSTRACT

在资源有限、监测能力不足的地区，新发传染病的风险日益加剧，这对全球及时识别和应对疾病威胁构成了严峻挑战。因此，开发并实施可行、经济、可持续的监测策略至关重要。分子异种监测（Molecular Xenosurveillance, MX）作为一种创新的虫媒病毒监测方法，通过现场采集的蚊虫标本检测循环病原体，为登革热等疾病提供早期预警。孟加拉国是登革热高度流行区，资源有限，MX的实施将有力补充现有监测工作。本研究旨在测试MX在检测埃及伊蚊（Ae. aegypti）中登革病毒的适用性，并建议将其整合入现有监测体系。

INTRODUCTION

世界卫生组织（WHO）估计，全球80%的人口面临一种或多种虫媒传染病（VBDs）的威胁，这类疾病占传染性疾病总负担的17%。东南亚地区已成为新发传染病（EIDs）的重灾区，尤其是具有流行或大流行潜力的虫媒传染病。人口增长、高密度城市化、人口流动和环境变化等因素显著推动了传染病的出现。

登革病毒感染是由雌性伊蚊传播的主要虫媒病之一，被WHO列为全球十大健康威胁之一。过去二十年间，全球报告的登革病例从50万例激增至520万例，增长了十倍。孟加拉国最早的登革病例记录可追溯至1964年，当时该病被非正式地称为“达卡热”，但直至1999年达卡爆发大规模疫情，登革才成为重大公共卫生问题。

自2000年以来，达卡及其他大都市频繁遭遇登革疫情，其中达卡是疫情中心。据孟加拉国卫生服务总局（DGHS）报告，2019年至2024年间，该国住院登革病例数分别为101,354例、28,429例、61,763例、321,179例和101,214例。在四种登革病毒血清型中，2013至2016年间以DENV-1和DENV-2为主，2019年疫情中DENV-3成为主导血清型，而2023年疫情中DENV-2再次成为主要流行株。

由于缺乏特效治疗或预防手段，控制和减少传播的有效策略主要依赖于实施蚊媒控制和提升公众意识。WHO将媒介监测、干预措施的监控与评估列为实现有效可持续蚊控的四大支柱之一。近年来，多国提出建立登革早期预警系统以遏制病毒传播。构建有效的预警系统十分复杂，需综合考虑宿主、环境、媒介和病毒本身的多重相互作用因素，因此气象、流行病学、人口和昆虫学（包括媒介数量和感染情况）等多类指标至关重要。

异种监测（Xenosurveillance）利用吸血节肢动物监测和识别脊椎动物病原体，为该领域提供了有价值的方法。追踪登革病毒在成蚊和幼蚊中的存在，是检测流行开始和指导及时措施的关键策略。孟加拉国以往的昆虫学研究多集中于评估媒介密度和分布，但估算和绘制蚊媒中登革病毒的流行情况同样重要。成功的媒介控制计划需全面了解媒介，包括其密度、抗药性和感染率。尽管孟加拉国尤其是达卡登革负担沉重、传播风险高，但有关媒介感染率的数据仍显不足。达卡低收入社区伊蚊数量众多，但其登革病毒感染情况尚未得到充分探索。

分子异种监测（MX）作为一种现代工具，通过分析野外采集媒介的遗传物质（DNA或RNA）来检测病原体，用于疾病监测。随着实验室技术的显著进步，MX已成为一种潜在的监测技术，能够灵敏、可操作地追踪病原体在媒介种群中的流通，甚至早于人类人群中的出现，使其成为早期疫情检测和应对的宝贵工具。MX已作为全球消除淋巴丝虫病计划的大规模药物给药后监测工具得到成功应用。多个登革流行国正努力建立MX，以评估媒介感染率、识别传播热点、通过预测模型预警疫情，并最终构建全面的早期预警系统以实施及时控制措施。这一创新方法有望彻底改变虫媒传染病/新发传染病的监测方式，并似乎适合在孟加拉国进行程序化使用。因此，我们首次在达卡市引入异种监测，以检测和鉴定埃及伊蚊中的登革病毒。本研究旨在为孟加拉国等类似环境建立登革MX，从而加强现有昆虫学监测，并指导在登革爆发高风险地区的大规模实施。

RESULTS

Vector distribution and physiological status

研究共捕获1,350只蚊虫，来自26个诱捕点（收集时间为6天），其中埃及伊蚊（Ae. aegypti）、致倦库蚊（Cx. quinquefasciatus）、三带喙库蚊（Cx. tritaeniorhynchus）和贪食库蚊（Ar. subalbatus）的数量分别为228只、992只、104只和26只。致倦库蚊是最优势物种，占总捕获量的73.48%，显著超过等比例假设下的预期值（χ2 = 1,753.8，自由度=3，P < 0.001）。其他三种蚊虫中，埃及伊蚊（16.89%）、三带喙库蚊（7.70%）和贪食库蚊（1.93%）占比均显著低于致倦库蚊，其中贪食库蚊尤为罕见。

在捕获的埃及伊蚊中，雌蚊和雄蚊分别为148只和80只。雌性埃及伊蚊中，48只为饱血状态，82只为未吸血状态，18只为妊娠状态。收集期间，两个诱捕点仅捕到埃及伊蚊，一个点仅捕到库蚊属蚊虫，七个点未捕到任何蚊虫。捕获的埃及伊蚊（包括雌雄）按诱捕点进一步分为26个池。

Molecular screening of the pools and prevalence estimation

在这26个池中，一个来自Basabo地区、包含10只埃及伊蚊的池在泛登革实时逆转录聚合酶链反应（RT-qPCR）筛选中呈登革病毒阳性。通过进一步RT-PCR检测，该阳性池中的病毒被确认为DENV-2血清型。利用PoolTestR工具的PoolPrev功能，将PCR结果视为来自单一研究区域（达卡市）的整体数据进行分析。最大似然估计显示，登革感染流行率为0.450%（95%置信区间：0.026%–1.960%）。贝叶斯估计则表明感染率略高，为0.51%（95%置信区间：0.053%–2.100%）。最小感染率（MIR）为4.39，这是基于阳性池中仅存在一只感染蚊虫的假设计算得出。

DISCUSSION

MX已被科学界广泛认可用于虫媒传染病/新发传染病的监测与监控。该工具可补充媒介管理策略，并有望提前向当局发出疫情警报。然而，该技术尚未纳入孟加拉国当前的媒介监测中。因此，本研究的总目标是建立一种MX工具，用于检测和鉴定媒介蚊虫中的登革病毒。

本研究首次提供了通过MX在孟加拉国成人伊蚊中检测到登革感染的证据。媒介中感染的存在表明社区中登革病毒正在持续传播。研究期间疫情的发生进一步强化了本研究的发现和病毒传播的事实。

孟加拉国先前的昆虫学监测研究多局限于估算房屋指数（幼虫/蛹阳性房屋百分比）、容器指数（幼虫/蛹阳性蓄水容器百分比）、布雷图指数（每100间受检房屋中幼虫/蛹阳性容器数）、成蚊数量、滋生地和杀虫剂抗性状态。由于蚊媒数量并不成比例地反映媒介感染率，且一些早期研究未能将上述指数与病例数及病毒从宿主向媒介传播关联起来，因此估算媒介感染率至关重要。

本研究中，我们证实了登革病毒在媒介中的存在，并鉴定其血清型为DENV-2，这与2023年孟加拉国疫情中患者的主要血清型（68.1%）一致。对媒介中登革病毒进行血清分型为了解血清型并行传播提供了宝贵信息，从而有助于预测疫情规模和疾病严重程度。

多个登革流行国已引入MX以辅助媒介监测。在印度一处流行城市，最小感染率为4.5，与本研究的MIR相近。该研究还报告了一池雄性埃及伊蚊登革病毒检测阳性，表明将雄蚊纳入检测的重要性。尽管雄蚊不吸血且非直接媒介，但其体内病毒RNA的存在可能表明垂直（经卵）传播的存在，即受感染雌蚊将病毒传给后代。这一机制可能在疫情间歇期维持病毒在蚊群中的存续，从而证明本研究将雄蚊纳入检测的合理性。巴西一项持续三年的成蚊收集研究报道MIR为19.8。

本研究的一个重要限制是样本量相对较小。此外，样本收集时间很短，限制了对感染率季节变化的探索。因此，为利用异种监测的见解构建成功的早期预警系统，需全年收集大量媒介并检测病原体。尽管本研究采用了适当的池筛查方法，但观察到的感染率并不能真实代表达卡市的情况。这一问题可通过增加空间和时间覆盖来克服。

尽管本试点研究存在局限性，但其发现将有助于量身定制强有力的登革监测策略。仅通过短期感染监测预测登革疫情几乎不可行。因此，需要全年监测计划以提供更精确的见解。此外，将幼蚊（幼虫和蛹）的感染监测纳入活动对流行地区评估病毒在流行间歇期的存续至关重要。该工具未来还有潜力作为宿主感染估计的代理手段，用于虫媒病监测。然而，必须全面理解人类和媒介中病原体感染率之间的相关性。除疾病监测外，MX数据还有助于制定或确定媒介控制干预措施的效果。在印度尼西亚，MX得出的媒介感染数据有望作为沃尔巴克氏体（Wolbachia）介导的媒介控制策略的基线信息。除检测单一病原体外，还可将多重分子检测整合入MX，以检测同一媒介传播的多种病原体。值得注意的是，登革、基孔肯雅和寨卡病毒共享同一媒介，因此对伊蚊进行MX可为了解这些病原体的合并流行或某一病原体在特定地区的出现提供见解。当前的MX工具需要成本高、专业性强的方法。因此，为使MX更经济可行，必须开发快速的核酸提取方法和更简便的分子检测方法（如RT-RPA、RT-LAMP），以替代RT-PCR而不牺牲灵敏度和特异性。

Conclusion

本研究证明了MX在检测媒介蚊虫中登革病毒流行和提供宝贵流行病学见解方面的潜力，这两者都是构建稳健早期预警系统的关键组成部分。此外，需开展大规模前瞻性研究以优化该工具，促其融入现有疾病监测计划。

MATERIALS AND METHODS

Field collection

作为孟加拉国卫生服务总局（DGHS）传染病控制单位昆虫学团队常规季前登革媒介调查的一部分，本次横断面研究得以开展。因此，由训练有素的昆虫学家和技术人员使用BG Sentinel-2诱捕器，以1汤匙酵母与15毫升10%糖溶液作为诱饵，在孟加拉国达卡的不同区域收集成蚊。区域涵盖达卡北城公司（DNCC）和达卡南城公司（DSCC）内的Rampura、Basabo、Kamalapur、Mirpur、Baunia、Banani和Dhanmondi。2023年6月20日至25日期间，共在随机选择的房屋中设置了26个诱捕器。每个诱捕器在房屋角落放置24小时（早9:00至次日早9:00）。研究完成的相关活动流程见图示。

Mosquito identification and processing

收集后，蚊虫在?20°C冷冻柜中放置至少20分钟（2小时内）以 immobilize。随后，将成蚊埃及伊蚊从混合蚊中分离，进行形态学鉴定和生理状态判定。蚊标本按诱捕点分池，每池不超过10只，并相应标记。分池后储存在?80°C直至RNA提取。

RNA extraction

采用Qiagen RNeasy Mini试剂盒提取蚊池RNA。每管加入600微升Buffer RLT，使用手持式微型匀浆器与塑料微杵匀浆至细腻。加入800微升70%乙醇，移液充分混合。随后，将700微升混合液转移至RNeasy离心柱，以8,000×g离心15秒，弃流出液。剩余混合液加入同一柱，重复该步骤。将样品加入RNeasy Mini离心柱后，按照试剂盒协议进行后续步骤，包括依次加入700微升Buffer RW1和500微升Buffer RPE进行两次洗涤。最后使用40微升无RNase水洗脱RNA。

Real-time one-step RT-PCR

对每个蚊池提取的RNA进行登革泛血清型实时一步RT-PCR。所用引物和探针参考Leparc-Goffarf等的工作，由Integrated DNA Technologies（IDT）合成。单重RT-PCR在Applied Biosystems 7500实时PCR仪上进行，使用2微升提取RNA、10微升2× QuantiNova Probe RT-PCR Master Mix、0.2微升Probe RT Mix、0.1微升ROX参考染料、450 nM正反向引物和225 nM探针（Taq），最终体积用无核酸酶水调整至20微升。热循环条件为：45°C 12分钟，95°C 5分钟，随后40个循环的95°C 5秒和60°C 40秒，于60°C收集荧光数据。

登革阳性池的RNA随后采用美国食品药品监督管理局（FDA）批准的CDC DENV-1-4 Real-Time RT-PCR多重检测（产品目录号KK0128）进行登革病毒血清型判定。多重RT-PCR在Bio-Rad CFX96实时PCR检测系统上进行，使用5微升提取RNA以及寡核苷酸引物和荧光探针（TaqMan）。热循环条件为：50°C 30分钟，95°C 2分钟，随后40个循环的95°C 15秒和60°C 1分钟，于60°C收集荧光数据。扩增曲线循环阈值（Ct）≤37视为阳性，Ct值>37为阴性。每轮RT-PCR中，无核酸酶水作为阴性对照，分子标准品作为阳性对照。

Data analysis

蚊标本收集信息及其分池情况录入单一数据库。RT-PCR分子筛查结果通过7500 Fast Software v2.3分析，并纳入上述数据库。感染流行率使用PoolTestR程序（默认参数）估算。这是一个基于R语言（R Core Team, 2020）的软件包，用于分析来自复杂MX调查的数据，涉及池或分组样本的检测。最小感染率（MIR）通过将登革阳性池数除以检测蚊总数再乘以1000计算得出。

ACKNOWLEDGMENTS

作者感谢伦敦卫生与热带医学院（英国）的Mary Cameron博士、Susana Campino博士、Mojca Kristan博士、Matthew Higgins博士和Emma Collins博士，以及icddr,b的Mohammad Shafiul Alam博士提供的技术支持。作者认可国家计划中所有昆虫学家、专家和技术人员在蚊虫收集和运输至实验室过程中的辛勤工作。

世界卫生组织孟加拉国国家办事处资助（采购订单号：203171596）了孟加拉国卫生服务总局传染病控制单位的MNI进行蚊虫收集及相关后续活动。实验室活动费用由MNI和icddr,b的DM共同承担。资助方在研究设计、数据收集与分析或发表决策中无任何角色。

作者独自对本文表达的观点负责，这些观点不一定代表其所属机构的观点、决策或政策。