极端嗜热古菌Thermococcus kodakarensis RNA聚合酶的RNA合成动力学特征及其对转录机制演化的启示

本综述系统阐述了超嗜热古菌Thermococcus kodakarensis RNA聚合酶（RNAP）的独特催化机制。研究发现该古菌RNAP在高温环境下形成异常稳定的转录延伸复合物（ECs），其核苷酸添加速率呈现显著温度依赖性但意外地缺乏NTP浓度依赖性。这一发现揭示了古菌与真核生物RNAP（Pol II）在保守结构下的差异化调控策略，为理解生命三域转录机制的演化提供了关键生化依据。

　　

ABSTRACT

在最广泛的分类学层面上，生命被划分为古菌（Archaea）、细菌（Bacteria）和真核生物（Eukarya）三大域。尽管原核的细菌和古菌与真核生物在细胞结构、代谢过程和原生环境方面存在显著差异，但RNA合成这一基本生物学过程在所有域中都是保守的。古菌是真核生物的祖先，单一的古菌RNA聚合酶（RNAP）与真核生物RNA聚合酶——特别是真核RNAP II（Pol II）——的同源性，凸显了共同的进化祖先，这导致了现代真核生物中至少三种不同的RNAP之间转录活动的分工。虽然对细菌和真核RNAP活性的详细动力学评估揭示了动力学延伸方案中的普遍性和显著差异，但与古菌来源的RNAP的相同比较在很大程度上是缺失的。本研究表征了模型超嗜热古菌Thermococcus kodakarensis（T. k.）RNAP的延伸特性，并将这些特性与先前表征的细菌和真核RNAP进行了比较。我们证明，T. k. RNAP在环境温度下形成的转录延伸复合物（ECs）比Pol II更稳定，并且在该古菌生长的高温下形成了非常稳定的复合物。我们出乎意料地观察到，在多个温度下，NTP浓度对古菌RNAP的核苷酸添加速率没有显著影响，这独特地将古菌RNAP与细菌和真核RNAP区分开来。我们的结果揭示了，尽管多亚基RNAP的整体高度保守结构和细胞功能，古菌RNAP仍可采用独特的调控策略。

IMPORTANCE

在所有生物体中，在动态条件下准确及时地调控基因表达对生存至关重要。控制转录起始和延伸速率是细胞适应性的一个关键参数，确定控制RNA聚合酶活性的保守和独特调控策略至关重要。古菌RNA聚合酶如何催化RNA合成，为了解生命极限下独特和保守的生存调控策略提供了见解。

INTRODUCTION

调控的RNA合成对所有生物体都是必需的。在所有真核生物中，DNA转录生成RNA由至少三种核内DNA依赖性RNA聚合酶（RNAPs）执行，最通常称为Pol I、Pol II和Pol III。相反，所有原核生物——包括细菌和古菌这两个截然不同的域——的所有RNA合成都在细胞质中由单一的DNA依赖性RNAP执行。尽管细菌、古菌和真核生物之间存在深远的进化分歧，但所有多亚基RNAP的整体结构和功能都是高度保守的，特别是RNAP催化核心亚基的保守性。虽然古菌RNAP可能是每个真核RNAP的祖先，但古菌RNAP和真核Pol II的密切同源性表明Pol II是原始的真核RNAP，它产生了Pol I和Pol III（以及植物中的Pol IV和Pol V）。

我们之前表征并对比了真核Pol I、II和III以及分枝杆菌RNAPs的酶学特性。为了进一步理解跨生命域生物的RNA合成，我们检查了Thermococcus kodakarensis（T. k.）RNAP的酶学特性。T. kodakarensis是一种从浅层喷气孔和热液喷口分离的海洋古菌。尽管T. kodakarensis自然存在于极端条件下，但它已很好地适应了85°C的厌氧实验室生长，使其成为模型超嗜热古菌物种。

在此，我们提出了在可以直接最直接比较细菌和真核RNAP动力学特性的条件下，对T. k. RNAP的生化表征。使用允许快速动力学测量的体外转录技术，我们鉴定了这种超嗜热古菌RNAP的独特酶学特性，这些特性共同阐明了古菌RNA合成的一些复杂性，并提供了与真核和细菌RNAP不同的、可能对极端条件下生存至关重要的酶学特性的见解。

RESULTS

T. k. RNAP transcription ECs are stable over the course of days at both high and low temperatures

T. k. RNAP的结构被解析，显示出与真核Pol II的显著同源性。考虑到该物种的自然环境，我们假设T. k. RNAP活性会表现出温度敏感性，但会催化与Pol II催化的核苷酸添加相似的反应机制。为了阐明T.k. RNAP的核苷酸添加循环，并在相同条件下比较细菌、古菌和真核RNAP的延伸特性，我们进行了体外转录实验以表征T. k. RNAP的生化特性。

考虑到我们对三个域RNAP的核苷酸添加循环和延伸动力学进行直接比较的目标，但细菌、古菌和真核生物采用的转录起始策略在DNA序列、辅因子、能量和基础转录因子要求方面存在根本差异，我们在合成核酸支架上组装了古菌转录复合物，该支架支持启动子非依赖性形成转录延伸复合物（ECs）。这种方法通常被描述为支架依赖性转录起始，它依赖于RNA聚合酶对短RNA:DNA杂交体的先天亲和力。酶与杂交体结合后，将复合物与完全互补的非模板DNA链孵育，产生双链DNA模板，并形成具有短新生RNA的完全形成的延伸复合物。该复合物为比较不同RNAP活性提供了一个理想的平台。对细菌、真核和古菌RNA聚合酶使用相同的DNA/RNA序列有助于确保观察到的任何活性差异是由于聚合酶本身的固有特性，而不是反应中使用的模板差异。

我们选择了两个温度进行一系列体外实验：25°C作为环境温度（以便直接比较细菌和真核RNAP的生化和动力学特性）和65°C，这接近用于转录分析的仪器的上限，并且处于该物种生长的温度范围内（约60°C–98°C）。我们首先评估了由T. k. RNAP与用于体外转录分析的合成核酸支架形成的转录延伸复合物（ECs）的整体稳定性。在EC组装（EC₊₉）后，提供α-³²P-CTP并作为下一个互补核苷酸掺入，形成10聚体RNA延伸复合物（EC₊₁₀），同时放射性标记新生RNA，以提供可量化的信号进行分析，并确保所有后续动力学数据均来自具有催化活性的ECs。掺入的放射性标记CMP用下划线表示，在序列中表示为C。由于省略了下一个互补底物（ATP），阻止了转录延伸超过10个核苷酸；随后添加EDTA螯合Mg²⁺，这进一步消除了NTP掺入。

将具有催化活性的EC₊₁₀置于去稳定盐溶液和RNase A中，以监测EC₊₁₀解组装的动力学。虽然完整的EC₊₁₀完全包裹并因此保护新生RNA免受RNase A切割，但RNAP的解离将10 nt RNA（5′-AUCGAGAGGC-3′）释放到溶液中，并允许RNaseA介导在10聚体RNA中唯一内部C的下游进行切割，从而去除最5′端的三个核苷酸，并将3′端放射性标记的10聚体RNA转化为3′端放射性标记的7聚体RNA。在去稳定盐溶液中，随时间量化放射性标记的10 nt和7 nt RNA物种的相对信号强度，确定了完整EC₊₁₀的比例。

先前对真核Pol I、II和III的表征揭示了真核EC复合物稳定性的两个数量级差异：Pol II ECs是真核Pol中最稳定的，复合物在25°C下约72小时内崩溃，而Pol III ECs保持完整约3小时，Pol I形成的ECs最不稳定，在约40分钟内崩溃。在相同条件下形成的T.k. RNAP的EC₊₁₀稳定性实验显示，无论温度如何，EC₊₁₀都异常长寿命。有趣的是，我们发现在相同的实验条件和温度下，T. k. EC₊₁₀稳定>96小时。即使在65°C的高温下，T. k. ECs仍保持完整超过24小时。我们的结果表明，T. k. RNAP对RNA:DNA杂交体提供了显著的稳定作用，因为65?C的实验高温远超过了RNA:DNA杂交体的预测熔点（约30°C）。

Single-nucleotide addition catalyzed by T. k. RNAP is temperature-, but not NTP-concentration dependent

为了表征T. k. RNAP催化的核苷酸添加机制，我们使用已建立的启动子非依赖性、快速混合、体外转录实验，在毫秒时间尺度上监测添加单个或部分NTPs在不同浓度下的核苷酸添加。将放射性标记的EC₊₁₀加载到化学淬灭流仪器（KinTek Corporation）中，与ATP、辅因子镁和肝素的溶液相对。ATP作为底物用于核苷酸添加，将EC₊₁₀转化为EC₊₁₁，肝素作为未结合RNAPs的陷阱，确保单转换反应条件。两个注射器的内容物在约2毫秒内混合，核苷酸添加反应进行用户确定的时间段——从5毫秒到10秒——然后用盐酸快速淬灭。每个时间点的RNA产物然后通过变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，该电泳可分辨放射性标记的10 nt和11 nt RNA。通过磷成像分析测量每个放射性标记RNA产物的密度，并使用KaleidaGraph进行模型无关分析。

在25°C和65°C下收集了描述由T. k. RNAP催化的单核苷酸添加事件的时间过程，覆盖了一系列ATP浓度。我们在25°C下观察到随时间形成11聚体的ATP浓度依赖性可忽略不计。我们注意到250 μM ATP显示出更高的信号幅度。幅度与控制核苷酸添加的速率常数无关，而是反映了信噪比的变化，这是由于³²P-放射性核苷酸的衰变程度或“新鲜度”所致。因此，在滴定时间过程中没有明显的趋势。核苷酸添加速率与ATP浓度无关这一事实突出了T.k. RNAP（或许还有其他古菌RNAPs）的一个独特特征，这与真核和细菌RNAP都形成鲜明对比，后者都显示出明显的ATP浓度依赖性核苷酸添加。

为了提取控制核苷酸添加的观测速率常数（k_obs）的值，使用非线性最小二乘法（NLLS）将数据拟合到双指数和，因为数据无法很好地用单指数拟合来描述。拟合到双指数和导致两个观测速率常数值：k_obs,_fast = (1.47 ± 1.14) s^?1 和 k_obs,slow = (0.35 ± 0.58) s^?1。这些速率常数值比在相同温度、相同条件和相同支架上评估的真核Pol I、II和III以及细菌RNAPs催化的核苷酸添加速率（~9–67 s^?1）慢一到两个数量级。

Model-dependent analysis of single-nucleotide addition catalyzed by T. k. RNAP at 25°C

在对25°C收集的时间过程进行模型无关分析后，我们确定了最简单的动力学模型或方案来描述T.k RNAP的单核苷酸添加事件。使用MATLAB工具MENOTR，我们将时间过程数据全局拟合到方案1。

方案1描述了ATP与EC₊₁₀的结合，由基本速率常数k₁控制，该常数固定为扩散极限1 × 10⁸ M^?1 s^?1。结合步骤是可逆的，由K_d描述，代表结合亲和力的度量。从EC₊₁₀到EC₊₁₁的键形成和延伸由k₃控制。该方案描述了所有可检测的、限速的步骤。我们的技术具有毫秒时间分辨率，但对核苷酸添加循环中潜在的更快步骤不敏感。

对25°C下所有ATP浓度的核苷酸添加进行全局拟合揭示了一个键形成步骤，其基本速率常数k₃ ~1.00 s^?1（上下界列于表中）。该速率常数与模型无关的计算一致，但比在相同核酸支架上评估的25°C下的细菌和真核RNAPs（~9–67 s^?1）慢得多。此外，底物结合亲和力（K_d）计算为~3 μM（上下界列于表中）。同样，该值显著低于所研究的其他RNAPs。这些数据的最简单解释是，在25°C下，T. k. RNAP与核苷酸结合得非常紧密，以至于键形成不利。缓慢的键形成速率常数和高的底物结合亲和力都可能是由于T.k. RNAP活性中心的温度依赖性变化，这些变化在更高温度下得到缓解。

我们假设在类似于T. k.生长的原生环境的更高温度下，核苷酸添加速率将更接近于为细菌和真核RNAPs建立的速率。虽然只有古菌酶可以在更高温度下监测催化作用，但在25°C和65°C下对单核苷酸添加反应的比较提供了关于T.k. RNAP转录延伸的温度依赖性的深刻信息。虽然25°C下的转录延伸速率比细菌和真核RNAPs慢一到两个数量级，但当在65°C下进行相同的反应时，在所有ATP浓度下，EC₊₁₀到EC₊₁₁的转化在第一个时间点（5 ms）之前就已完成。由于EC₊₁₁的积累在最早可达到的时间点之前就已完成，我们只能估计65°C下单核苷酸添加的观测速率常数的下限。拟合到单指数，我们确定下限为301 ± 65 s^?1。值得注意的是，该速率常数比25°C下更稳健的观测速率常数（仅1.47 ± 1.14 s^?1）快两个多数量级，并且现在比细菌和真核RNAPs更快——甚至可能快得多。正如在25?C下观察到的那样，T.k. RNAP在65?C下的核苷酸添加没有显示ATP浓度依赖性。

Model-dependent analysis of multiple nucleotide addition events catalyzed by T. k. RNAP

鉴于T.k. RNAP在65?C下掺入单个核苷酸的速度比我们即使使用快速混合也能测量的速度更快，我们转向测量多个连续的核苷酸添加事件，以更准确地确定这种古菌RNAP在不同温度和NTP浓度下的核苷酸添加动力学。为了在25°C和65°C下观察可量化的核苷酸添加，我们采用了先前描述的相同的启动子非依赖性体外转录程序，仅有一个改动：在溶液中同时添加GTP和ATP。根据模板DNA序列，与ATP和GTP孵育将导致九个连续的核苷酸添加事件，将10聚体新生RNA延伸至19聚体，序列为5′-AUCGAGAGGCAGGAGGGAA-3′。位置+20的互补核苷酸是UTP，溶液中未提供。

与T. k. RNAP的单核苷酸添加时间过程类似，我们观察到65°C下的多核苷酸添加比25°C下快得多。在25°C下收集了四种ATP和GTP浓度的时间过程。在九个潜在的RNA中间体中，在25°C下，在我们的10秒时间过程中仅观察到三种RNA物种：11聚体、12聚体和13聚体。这一观察表明，不仅控制核苷酸添加的速率常数很慢，而且T.k. RNAP的转录延伸超过几个核苷酸受到抑制，暗示了25?C下易位的缺陷。

25?C时间过程使用MENOTR和方案A进行全局最小化，该方案包括每个产物之间的单个速率常数。为了解释痕量的13聚体及以上的延伸产物，我们模拟了11聚体、12聚体的形成和衰减，以及13聚体+ RNA物种（定义为所有至少13个核苷酸长的RNA物种）的形成。我们使用不可逆方案评估了拟合的可靠性，但发现数据点描述不佳。

接下来，我们修改了方案A，以包括每个RNA中间体形成之间的可逆性，由化学反应方案2描述。RNA中间体之间可逆性的要求先前在其他RNAPs中观察到，表明焦磷酸（PPi）在磷酸二酯键形成后可能被 transiently 隔离在活性位点。代表性时间过程的可视化如图所示。每个ATP和GTP浓度对应的观测速率常数值列于表中。我们再次观察到非常慢的速率常数，并且没有显著的NTP浓度依赖性核苷酸添加，这与25°C下的单核苷酸添加结果一致。

我们还在65°C下用相同的ATP和GTP浓度进行了多核苷酸添加实验。我们使用相同的反应方案来描述11聚体、12聚体的形成和衰减，以及13聚体+物种的形成。在65°C下，核苷酸添加要快得多。我们再次观察到，对于我们设备最早可达到的时间点，11聚体的形成已经发生。类似地，对于所有测试的ATP和GTP浓度，12聚体物种在最早的时间点也存在。为了更自信地确定65°C下T. k. RNAP随时间推移的RNA合成速率，我们评估了13聚体+物种的形成，并使用这些RNA产物的形成来确定描述核苷酸添加的平均观测速率常数。65°C下的多核苷酸添加图如图所示，相应的观测速率常数列于表中。为了确保这种分析方法没有排除11聚体和12聚体RNA形成中的可用数据，我们确定了这些物种在每个NTP浓度下的半衰期。半衰期值确定仅为3.4 ± 0.8 ms，这仍然比化学淬灭流的可检测极限（5 ms）快，意味着这些RNA中间体无法量化。

我们强调k_obs,5作为描述65°C下T. k. RNAP催化的核苷酸添加的特征，在四种NTP浓度下平均为102 ± 46.7 s^?1。该值再次比在相同条件下25°C下测量的速率常数大两个数量级。在用于描述核苷酸添加的动力学机制中，k_obs,5描述了键形成和RNA延伸至更高级寡聚体的过程。在NTP浓度 > 10 μM时，我们没有观察到NTP浓度对描述键形成的速率常数有显著依赖性。有可能10 μM NTP浓度低到足以挑战快速平衡的假设，正如我们在25°C下对其他RNAPs所观察到的那样，或者RNAPs已经进化到响应NTP剥夺作为一种应激反应。

对于25°C下的T. k. RNAP核苷酸添加，我们没有观察到任何动力学常数或参数值有显著的NTP浓度依赖性。控制核苷酸添加的速率常数缺乏显著的NTP浓度依赖性，这一点在相同合成核酸支架上表征的真核和细菌RNAPs中尚未观察到。T. k. RNAP核苷酸添加中缺乏NTP浓度依赖性表明，在25°C下，核苷酸结合的机制可能与键形成解耦。由于描述键形成的速率常数非常慢，我们假设在25°C下，限速因素不是NTP丰度，而是酶构象的缓慢异构化以允许核苷酸添加。在65?C下，核苷酸添加速率快了两个数量级，但再次显示没有明显的NTP浓度依赖性，这表明温度影响整体核苷酸添加动力学，但NTP浓度对T.k. RNAP不是限制因素。

DISCUSSION

在本研究中，我们使用一系列体外转录实验表征了T. k. RNAP的酶学特性，以阐明这种模型超嗜热古菌RNAP的独特酶学特性，并在近乎相同的条件下与细菌和真核RNAP进行比较。这项研究揭示了T.k.酶的三个出乎意料的独特特征：(i) T. k. RNAP形成异常稳定的转录延伸复合物，(ii) T. k. RNAP对反应温度高度敏感，以及(iii) T. k. RNAP在生理范围内对NTP浓度的变化没有响应。

T.k. RNAP形成了非常稳定的ECs，其寿命甚至比在相同实验条件下的Pol II ECs更长。T. k. ECs的长寿命表明，超嗜热生长的环境压力导致了ECs足够稳定，可以在可能损害并 potentially 变性来自嗜温生物的RNAPs的温度下保持完整。此外，与细菌RNAP不同，许多古菌酶必须 navigate 基于组蛋白的染色质化模板。也许在染色质修饰剂有限的背景下，这种障碍选择了高度稳定的转录延伸复合物。鉴于嗜温真核和大多数细菌RNAPs的蛋白质热不稳定性，在高温下直接与T.k RNAP进行比较是不可能的。

虽然温度升高对酶动力学的热力学影响已被认识多年，但我们观察到的T. k. RNAP核苷酸添加在低温和高温下延伸速率的显著差异比预期的更为 striking。在我们之前对在相同支架上组装的真核和细菌RNAPs的表征中，我们没有观察到中间RNA物种如此快速的形成。在25°C下，T. k. RNAP的EC稳定性、延伸速率常数和结合亲和力不利于进行性转录延伸。在允许生长的温度下，EC稳定性与快速核苷酸添加相结合导致稳健和高效的延伸，但在25?C和65?C下，T.k. RNAP的延伸速率在很大程度上对NTP浓度不敏感。

我们之前对真核Pol I、II和III以及分枝杆菌RNAPs的单次和多次核苷酸添加事件的表征都表明，控制核苷酸添加的观测速率常数在一定程度上存在NTP浓度依赖性。我们发现T. k. RNAP没有表现出这种多亚基RNAPs otherwise 高度保守的酶学特性，这是令人费解的。一项对跨真核生物、细菌和古菌的生物体的荟萃分析发现，所有分析的生物体其细胞内ATP浓度都在1-10 mM范围内，平均约为4 mM，这表明基于起源域，核苷酸的细胞内浓度没有显著差异。因此，我们假设T. k. RNAP展示了一种核苷酸添加机制，其限速因素不是可用的NTPs，而是RNAP的构象或 potentially 反式作用因子（在我们的分析中不存在）的结合。我们的发现突出了选择性压力对转录延伸复合物稳定性以及控制低温和高温下核苷酸添加的速率常数的影响。T. k. RNAP核心催化功能与真核酶的差异表明，在两个域中可能部署了 novel 的调控策略。不同的限速步骤将产生 alternative 的控制机制。未来的研究将继续阐明温度对控制RNA合成的分子机制以及古菌RNAPs所采用的调控机制的影响。

MATERIALS AND METHODS

Buffers

体外时间过程在反应缓冲液A中进行：（40 mM KCl, 20 mM Tris-Acetate, pH 8.39 at 25°C, 2 mM dithiothreitol (DTT), 0.2 mg·mL^?1 bovine serum albumin [BSA]）；组分在使用前立即从储备液制备。65°C时间过程在相同的反应缓冲液中进行，该缓冲液pH调整至65°C下为8.39。

Protein purification

纯化如先前所述进行。

Oligonucleotides

所有模板、非模板和引物寡核苷酸/寡核糖核苷酸均从Integrated DNA Technologies (Coralville, IA)购买。寡核苷酸经过凝胶纯化，并且DNA和RNA寡核苷酸和寡核糖核苷酸均针对缓冲液A进行透析。

模板DNA序列：

5′?ACCAGCAGGCCGATTGGGATGGGTATTCCCTCCTGCCTCTCGATGGCTGTAAGTATCCTATAGG?3′

非模板DNA序列：

5′?CCTATAGGATACTTACAGCCATCGAGAGGCAGGAGGGAATACCCATCCCAATCGGCCTGCTGGT?3′

RNA引物序列：

5′-AUCGAGAGG-3′

Elongation complex stability time courses

延伸复合物稳定性实验如先前所述进行。简而言之，将标记的ECs与750 mM KCl和RNase A的溶液混合。完整ECs的比例相对于起始材料进行归一化并绘图，无需拟合。RNase A切割位点指示如下：

5′-AUC│GAGAGGC-3′

Rapid mixing time courses

纯化的T. k. RNAP与预退火的RNA:DNA杂交体在环境温度下孵育10分钟，然后加入完全互补的非模板DNA并在环境温度下孵育10分钟以形成活性ECs。然后通过添加α-³²P-CTP和Mg²⁺在环境温度下对ECs进行放射性标记。通过添加EDTA终止标记反应。然后将放射性标记的ECs加载到KinTek化学淬灭流（KinTek Corporation, Snow Shoe, PA）的左侧注射器中。右侧注射器中首先是缓冲液A的空白用于收集零时间点，然后是ATP或ATP和GTP的溶液。两个注射器的内容物由机器在约2毫秒内快速混合，然后反应进行用户确定的时间段。反应用1 M HCl快速淬灭。淬灭流通过持续循环的水浴维持在25°C或65°C。

收集的样品被中和，然后与甲酰胺储存染料混合。RNA产物然后通过聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，成像，并使用磷成像分析进行定量。

Data analysis

每种ATP浓度以及ATP和GTP浓度的至少三个时间过程用于最终数据分析。数据点的归一化信号强度首先使用KaleidaGraph (Synergy Software, Reading, PA) 绘制，用于模型无关分析。在25°C收集的单核苷酸添加时间过程拟合到方程1。

参数值的确定和观测速率常数的计算使用MatLab工具箱MENOTR (Multi-start Evolutionary Nonlinear OpTimizeR) 对每个数据集进行。该工具使用非线性最小二乘法（NLLS）和遗传算法分析的混合，以在给定数据和提供的动力学方案的情况下识别最佳拟合。

ACKNOWLEDGMENTS

本研究由美国国家普通医学科学研究所（#GM140710 to D.A.S. and #GM143963 to T.J.S.）和美国国家科学基金会（#MCB2346165 to A.L.L. and D.A.S.）资助。