RNA三螺旋结构通过阻止poly(A)尾去腺苷酸化增强逆转录转座子 mobilization 的机制研究

本研究揭示了拟南芥逆转录转座子Evade通过3′ UTR的ENE motif形成RNA三螺旋结构，有效抵御CCR4a介导的mRNA deadenylation（去腺苷酸化），显著增强转录本稳定性和转座活性。该发现为理解宿主-转座子分子军备竞赛提供了关键机制视角，对RNA稳定性调控和基因组进化研究具有重要启示意义。

　　

Significance

转座元件（TEs）是能够在基因组内移动的DNA片段，尽管细胞通常通过表观遗传沉默和RNA降解等机制抑制其活性。在拟南芥中，一个名为Copia93（或Evade）的逆转录转座子表现出异常高的移动性。研究发现，其RNA中的ENE motif与poly(A)尾形成保护性三螺旋结构，有效避免RNA降解。删除该motif会显著降低Evade RNA的稳定性和转座能力。细胞中的去腺苷酸化酶CCR4a通常通过缩短Evade RNA的poly(A)尾来抑制其活性，而CCR4a缺失时，Evade活性增强，但其他去腺苷酸化酶仍可参与调控。本研究揭示了Evade利用RNA结构抵抗宿主防御的分子机制，展现了移动DNA与宿主控制系统之间的分子拉锯战。

Abstract

转座元件（TEs）作为广泛存在的移动DNA，受到表观遗传沉默和RNA降解等细胞机制的严格抑制，但部分TEs仍保留转座能力。拟南芥长末端重复逆转录转座子Copia93（即Evade）表现出极高的转座活性，但其机制尚不明确。本研究发现，Evade的3′ UTR中存在一个核表达元件（ENE）motif，该motif与poly(A)尾形成RNA三螺旋结构，保护转录本免受去腺苷酸化和降解。删除ENE motif显著降低Evade转录本稳定性、染色体外DNA水平及新插入事件。此外，研究证实mRNA去腺苷酸化酶CCR4a直接结合Evade RNA并缩短其poly(A)尾，从而抑制转座。CCR4a缺失导致Evade上调，而其他去腺苷酸化酶在CCR4a缺失时仍可发挥抑制作用。这些发现揭示了一种基于RNA的策略，可增强转座子稳定性和移动性，体现了宿主沉默途径与TE编码结构元件之间的协同进化军备竞赛。

背景介绍

转座元件（TE）作为几乎存在于所有真核基因组中的移动DNA，其转座可能对宿主基因组造成有害影响，例如破坏关键基因的编码序列。在真核生物中，转座子的有害效应主要通过表观遗传机制抑制，其中植物中小干扰RNA（siRNA）介导的RNA-directed DNA methylation（RdDM）途径起主要作用。即使在外界胁迫或生殖期被转录的活跃TE，也会通过RDR6-DCL2/4模块产生的21/22nt-siRNAs进行抑制。此外，近期研究表明，除siRNA介导的抑制外，RNA去腺苷酸化在限制TE增殖中扮演关键角色，暗示转座子受到宿主多种抑制机制的调控。

尽管转座子活性受到严格调控，拟南芥基因组中仍存在少数具有转座能力的TE，例如Copia型长末端重复（LTR）逆转录转座子Copia93（即Evade）。该元件在met1突变体和DDM1及siRNA生物合成因子突变体中均表现出活跃转座，且在自然群体中存在大量独立插入事件，表明其具有强大的进化增殖能力。然而，Evade如何克服宿主抑制机制实现高效转座仍不清楚。

RNA二级结构在逆转录转座子和逆转录病毒的调控中具有重要作用。其中，核表达元件（ENE）motif特征为3′ UTR中的U富集重复序列，最初发现于卡波西肉瘤相关疱疹病毒（KSHV）的PAN长链非编码RNA（lncRNA）中。后续研究表明，ENE序列存在于多种病毒和真核生物的lncRNA及mRNA中，并通过与poly(A)尾形成三螺旋结构保护RNA3′端免受去腺苷酸化。生物信息学分析发现，ENE motif与LTR逆转录转座子密切相关，提示其在植物转座子调控中的潜在生物学意义。

Results

ENE RNA Triplex Formation of Evade

与大多数转座子不同，Evade逆转录转座子表现出异常强的转座活性。序列分析发现，Evade在ORF与下游LTR之间存在较长的间隔区，其中包含4个独特的U富集重复序列，侧翼为可形成回折结构的碱基配对区域。mFold软件预测显示，该区域可形成茎环结构，且U富集序列位于内部环区。为验证其是否形成RNA三螺旋，研究通过体外热变性实验（TDA）检测RNA结构稳定性。结果表明，ENE与A20 RNA混合物呈现明显的双相熔解曲线，而单独ENE RNA的低温峰显著减弱，证实Evade ENE motif可在体外形成三螺旋结构。

进一步通过突变实验发现，U富集内部环区的突变（如突变2和5）会消除熔解曲线的第一相变，而茎区A-U配对破坏（突变7）不影响双相模式。此外，紧邻U富集域的G-C配对对三螺旋形成至关重要（突变1、3、4和6），与既往研究一致。这些结果证明，U富集域及其侧翼G-C配对是Evade ENE motif形成RNA三螺旋结构的关键。

Evade ENE Motif Enhances Gene Expression

已知ENE RNA三螺旋可稳定转录本并增强基因表达，为探究Evade ENE motif在植物中的类似功能，研究通过烟草瞬时表达实验，将eGFP报告基因与含或不含ENE motif的3′ UTR构建体转染。RT-qPCR分析显示，ENE motif的存在显著提高eGFP表达水平。类似地，在烟草农杆菌浸润实验中，Evade ORF连接的荧光素酶基因在包含ENE序列时活性显著增强。这些结果提示，Evade ENE motif可能通过稳定转录本促进植物细胞中的基因表达。

ENE Motif Promotes Evade Mobility

为探究ENE motif在Evade转座中的功能，研究利用CRISPR-Cas9构建ENE缺失突变体（evade-1和evade-2），并通过诱导ddm1突变激活Evade转录。结果显示，evade-1 ddm1和evade-2 ddm1双突变体中Evade稳态mRNA水平显著低于ddm1单突变体。通过染色体外线性DNA（eclDNA）的ALE-qPCR分析发现，ENE缺失导致Evade eclDNA水平显著降低。ddPCR检测进一步证实，evade-1 ddm1突变体中Evade拷贝数低于ddm1单突变体。这些结果表明，ENE motif对Evade转录本稳定性和转座活性具有关键作用。

基于RNA三螺旋形成及表达增强现象，研究推测ENE结构可能通过稳定Evade转录本发挥作用。通过体内RNA衰减实验发现，ENE缺失导致Evade mRNA稳定性显著降低。综上，这些发现强烈提示ENE motif通过与poly(A)尾形成RNA三螺旋结构增强Evade RNA稳定性，从而促进其逆转录转座活性。

mRNA Deadenylase CCR4a Directly Targets Evade for Suppression

上述结果表明，Evade转座在RNA代谢水平受到调控，特别是mRNA poly(A)尾动态变化，包括去腺苷酸化这一mRNA衰变关键步骤。既往研究发现，mRNA去腺苷酸化酶CCR4a通过缩短转座子RNA尾抑制其转座，且CCR4a缺失导致多个转座子家族（包括Evade）过度增殖。为验证CCR4a是否通过直接调控Evade RNA稳定性抑制转座，研究构建了ccr4a-1 ddm1双突变体。RT-qPCR和ALE-qPCR分析显示，CCR4a突变导致Evade RNA和eclDNA水平显著上调，支持CCR4a在抑制Evade转座中的关键作用。

通过RIP-qPCR实验，研究进一步检测CCR4a与Evade RNA的直接结合。结果显示，CCR4a-FLAG在Evade RNA的3′端及ENE motif附近显著富集。利用Oxford Nanopore直接RNA测序（ONT-DRS）分析poly(A)尾长度发现，ccr4a-1 ddm1突变体中Evade转录本的poly(A)尾显著长于ddm1单突变体。这些结果证实，mRNA去腺苷酸化酶CCR4a直接结合Evade RNA并通过缩短其poly(A)尾抑制转座。

为探究ENE RNA结构 motif与CCR4a的遗传关系，研究构建了evade-1 ccr4a-1 ddm1三突变体。结果显示，三突变体中Evade RNA水平和拷贝数均显著低于ccr4a-1 ddm1双突变体，提示其他mRNA去腺苷酸化酶在CCR4a缺失时可能补偿其功能。RNA-seq分析发现，ccr4b及caf1a caf1b双突变体中Evade RNA水平显著升高，表明CCR4b、CAF1a和CAF1b等其他去腺苷酸化酶也参与Evade RNA的去腺苷酸化过程。

Discussion

转座子受到宿主严格监视机制的抑制以维持基因组完整性，但部分TE（如拟南芥Evade）仍表现出异常高的转座活性。本研究发现在Evade的3′ UTR中存在ENE RNA结构 motif，其在增强转录本稳定性和转座活性中起关键作用。Evade通过RNA-based策略逃逸宿主抑制的机制，为理解TE与宿主的分子军备竞赛提供了新视角。

体外实验证实，Evade ENE motif与poly(A)尾形成三螺旋结构，该机制与病毒和哺乳动物非编码RNA中的报道一致。三螺旋形成有效保护Evade转录本免受mRNA衰变途径的降解，通过延长转录本寿命赋予其选择性优势。鉴于Evade是拟南芥中最活跃的逆转录转座子之一，RNA结构元件可能作为其维持持续活性的关键调控特征。值得注意的是，Evade是ddm1突变体中众多转录激活但转座惰性的转座子里唯一在3′ UTR含有ENE motif的元件，这一独特特征可能解释其非凡的移动性。

Evade利用ENE介导的策略对抗宿主抑制，为转座子与宿主基因组的协同进化军备竞赛提供了生动例证。尽管植物已发展出强大的RNA沉默和降解机制抑制转座子，Evade似乎进化出RNA-based策略以规避这些防御。虽然ENE motif在拟南芥基因组中较为罕见，但既往研究在多种植物转座子RNA中发现类似motif，提示ENE介导的转录本稳定化可能是一种保守的TE生存策略。

本研究开辟了探索RNA二级结构如何影响转座子生物学及宿主基因组进化的新途径。未来研究应关注其他植物转座子中是否存在类似ENE-like motif，并评估其在TE调控中的功能意义。此外，鉴于TE对基因组进化的潜在影响，解析RNA结构元件与宿主沉默机制的相互作用可为基因组工程和TE-based生物技术应用提供策略依据。

Materials and Methods

Plant Materials and Growth Condition

本研究所有拟南芥植株均为Col-0背景。突变体种子（ccr4a-1、ccr4b-1、caf1a-1、caf1b-3）来自拟南芥资源中心（ABRC），并通过基因型验证。evade-1和evade-2突变体通过CRISPR-Cas9靶向Evade的ENE motif构建。evade-1 ccr4a-1双突变体通过单突变体杂交获得。新生DDM1突变体在指定突变背景中通过CRISPR-Cas9产生。CRISPR载体构建参照既往方法，基因分型所用引物序列见附表。

种子经75%乙醇表面灭菌后播种于MS培养基（0.43 g/L MS盐、3 g/L蔗糖、0.8%琼脂，pH 5.8）。4°C春化3天后，植株于22°C长日照条件（16小时光照/8小时黑暗）下生长。所有实验使用全幼苗样品。

TDA

含完整ENE及突变ENE序列的Evade片段通过合成寡核苷酸模板PCR扩增制备。PCR产物用于体外转录（HiScribe T7 High Yield RNA Synthesis Kit），转录RNA经Monarch? RNA Cleanup Kit纯化。3 μM RNA与A20（20-nt A重复RNA寡核苷酸）以1:1摩尔比混合于20 μL孵育缓冲液[10 mM Tris-HCl (pH 7)和10 mM MgCl₂]。混合物95°C加热55秒后缓慢冷却至室温复性。随后通过50至95°C升温进行缓慢变性，SYBR Gold用于可视化碱基配对和结构RNA。荧光监测熔解曲线使用CFX96 Connect Real-Time PCR Detection System检测。Evade ENE片段序列见附表。

RT Followed by qPCR (RT-qPCR)

RT-qPCR实验参照制造商指令及既往方法进行。植物RNA使用TRIzol溶液提取，ReverTra Ace qPCR RT Master Mix with gDNA Remover用于反转录。所得cDNA通过ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix在CFX96 Connect Real-Time PCR Detection System上进行定量PCR。拟南芥中以Actin2 (AT3G18780)、烟草中以EF-1α为内参，RNA水平通过2^?ΔΔCt法计算。所用引物序列见附表。

ddPCR

逆转录转座子DNA拷贝数通过ddPCR评估（TargetingOne? Digital PCR System）。100 ng总DNA经限制酶AluI消化后，反应体系包含2× ddPCR Supermix、0.8 μM各引物、0.25 μM探针及0.6 ng消化DNA。混合物与180 μL微滴生成油加载于微滴生成芯片，生成微滴（约50,000–60,000/测试）转移至8联PCR管，在PTC-200 Thermal Cycler上运行PCR（95°C 10分钟，95°C 30秒和56.8°C 1分钟循环55次，98°C 10分钟酶失活）。PCR后通过芯片阅读器检测FAM（488 nm）和HEX（532 nm）荧光信号，荧光微滴数量经Chip Reader R1软件进行泊松分布分析。引物和探针序列见附表。

Tobacco Transient Expression

本氏烟草植株于22°C可控环境 chamber（16小时光照/8小时黑暗）土壤中生长。4周龄植株用于农杆菌GV3101（含辅助质粒p19）浸润，3天后收集叶盘。所有组织样品来自三个重复植株。引物序列见附表。

Dual-Luciferase (Dual-LUC) Assay

双荧光素酶实验中，构建pUBQ10::EVADE-Fluc:tHSP18.2和pUBQ10::EVADE-Fluc:ENE-tHSP18.2载体。Renilla luciferase（Rluc）基因由组成型enTCUP2启动子驱动作为内参。质粒转化至农杆菌GV3101后浸润烟草叶片，48小时后收集叶片并通过Dual-Luciferase? Reporter Assay System测量Fluc和Rluc活性。进行三个生物学重复。所有引物序列见附表。

Transcription Arrest Profiling

4天龄拟南芥幼苗置于含蛹虫草素（1 mM PIPES (pH 6.25)、15 mM蔗糖、1 mM氯化钾、1 mM柠檬酸钠和1 mM cordycepin）的孵育缓冲液浸润滤纸上。为促进蛹虫草素吸收，植物组织真空浸润三次（每次1分钟）。样品于0、30、60、120和240分钟收取用于RT-qPCR。

Amplification of LTR of eclDNA (ALE)-qPCR

ALE-qPCR参照既往方法进行。植物总DNA使用Plant Genomic DNA Kit纯化。200 ng总DNA与1 pg PCR扩增PopRice DNA连接0.5 μL 40 μM接头DNA，16°C过夜。AMPure XP beads以1:0.5比例去除未连接接头并回收连接DNA。随后使用Standard RNA Synthesis Kit进行T7体外转录反应，合成RNA产物经Monarch RNA Cleanup Kit纯化。1 μg RNA通过Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit反转录获得cDNA。为降解非模板RNA，添加1 μL RNase A/T1并于37°C孵育30分钟。最后按上述方法进行qPCR，寡核苷酸序列见附表。

RIP-qPCR

RIP-qPCR用于评估蛋白与转录本的结合，参照既往方法。表达pCCR4a::CCR4a-FLAG的ccr4a-1 ddm1植株及表达p35S::FLAG的Col-0植株于22°C长日照条件生长12天。收取2 g幼苗，1%甲醛溶液真空交联10分钟，0.125 M甘氨酸淬灭。植物样品水洗后液氮速冻并研磨成细粉。冻粉于2 mL提取缓冲液[100 mM Tris-HCl (pH 7.5)、150 mM NaCl、0.5% IGEPAL、40 U/mL RNase抑制剂和1%植物蛋白酶抑制剂 cocktail]中匀浆，4°C旋转2小时后18,000×g 4°C离心20分钟。取上清，RNA通过Branson sonifier超声处理（7×10秒，间隔20秒，低振幅）剪切至200–400 nt。2 mL样品中加入70 μL抗FLAG beads，4°C孵育过夜。取200 μL溶液作为input样本保存于-80°C。孵育后，beads用1 mL提取缓冲液洗涤四次，重悬于150 μL蛋白酶K缓冲液（15 μL 10% SDS、18 μL 10 mg/mL蛋白酶K和117 μL提取缓冲液），55°C孵育30分钟。RNA通过TRIzol法提取，保存的input样本同样处理。免疫沉淀及input RNA按上述方法进行cDNA合成和qPCR。寡核苷酸序列见附表。