基于BONCAT新生蛋白质组学解析海胆卵源高分支糖原GCEP2a通过多受体/多通路网络激活巨噬细胞的全局免疫机制

本研究首次运用BONCAT新生蛋白质组学技术，揭示海胆（Glyptocidaris crenularis）卵源高分支糖原GCEP2a通过协同激活TLRs/CLRs/RLRs模式识别受体，联动NF-κB/MAPK/PI3K-AKT信号通路并重塑鞘脂代谢的重编程机制，为海洋多糖免疫佐剂开发提供全新视角。

　　

^◆ 缩写术语

AHA：L-叠氮高丙氨酸

BCA：二辛可宁酸（bicinchoninic acid）

BONCAT：生物正交非经典氨基酸标记（bioorthogonal non-canonical amino acid labeling）

CCL2：C-C motif趋化因子配体2

CLRs：C型凝集素受体（C-type lectin receptors）

CH₃I：碘甲烷

COX-2：环氧化酶-2

DCFH-DA：2′,7′-二氯二氢荧光素二乙酸酯

DEAE：二乙氨基乙醇纤维素

DEPs：差异表达蛋白

DIA：数据非依赖采集

DTT：二硫苏糖醇

FC：倍数变化

FBS：胎牛血清

FAIMS：高场不对称波形离子迁移谱

GCEP2a：纯化糖原

^◆ 材料与试剂

2023年7月于中国黄海海域（东经122°28′-123°21′，北纬39°13′-39°32′）采集 Glyptocidaris crenularis；一氧化氮检测试剂盒、大肠杆菌055:B5来源脂多糖（LPS）、无甲硫氨酸DMEM高糖培养基、L-甲硫氨酸、L-谷氨酰胺及BCA试剂盒购自碧云天；碘甲烷与硼氢化钠购自安耐吉；RAW264.7巨噬细胞购自科佰生物。

^◆ GCEP2a制备

采用碱提结合酶解法从海胆卵中制备粗多糖（GCEP），并通过DEAE阴离子交换色谱进行纯化。根据线性梯度洗脱结果中各多糖峰对应的NaCl浓度优化洗脱梯度（图A.1），最终采用四步梯度洗脱完成分离。

^◆ 讨论

本研究通过BONCAT新生蛋白质组学技术，系统阐释GCEP2a激活RAW264.7巨噬细胞的全局分子机制，揭示其通过模式识别受体（PRRs）网络与信号通路协同触发免疫应答的能力，为海洋多糖免疫调节机制研究提供理论支撑。

^◆ 结论

首次运用BONCAT新生蛋白质组学技术解析GCEP2a诱导的巨噬细胞动态蛋白表达谱，通过生物信息学分析与Western blot验证，阐明其通过多模式识别受体与信号通路网络激活巨噬细胞的全局机制，为海洋糖原类免疫佐剂开发提供新策略。