脉冲电场辅助提取酿酒酵母中高纯度谷胱甘肽及其在葡萄汁中抗氧化功效评估

本研究针对葡萄酒酿造中SO2使用引发的健康争议，开发了通过氨基酸补料结合脉冲电场(PEF)技术从酿酒酵母中高效提取谷胱甘肽(GSH)的创新工艺。研究证实PEF-GSH提取物具有卓越的抗氧化活性，在葡萄汁模型中能有效抑制氧化褐变，与SO2联用可降低50%亚硫酸盐用量，为减少葡萄酒酿造中化学添加剂提供了新策略。

　　

在葡萄酒酿造的传统工艺中，二氧化硫(SO₂)始终扮演着不可或缺的角色。自18世纪以来，这种添加剂就因其卓越的抗氧化和抗菌特性而被广泛使用。然而，随着现代健康意识的提升，SO₂的应用正面临严峻挑战。科学研究表明，SO₂可能引发过敏反应和呼吸系统问题，特别是对敏感人群存在健康风险。与此同时，全球范围内的法规限制也日益严格，促使酿酒行业寻求更安全、更天然的替代方案。

在这样的背景下，一种名为谷胱甘肽(Glutathione, GSH)的天然物质进入了研究人员的视野。这种由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸组成的三肽分子，不仅存在于酵母细胞中，也天然分布于葡萄等植物中。更重要的是，GSH分子中的巯基(-SH)赋予其强大的抗氧化能力，能够有效防止白葡萄酒的氧化褐变，同时保护决定葡萄酒风味的挥发性香气化合物。国际葡萄与葡萄酒组织(OIV)早在2015年就批准了GSH在葡萄酒酿造中的应用，为其商业化应用铺平了道路。

然而，高纯度的GSH生产成本昂贵，限制了其大规模应用。目前市场上主要的替代方案是富含GSH的灭活酵母制剂，但这些产品存在浊度高、蛋白质含量大等问题，可能影响葡萄酒的澄清度和品质。如何高效、经济地从酵母细胞中提取高纯度的GSH，成为制约这一天然抗氧化剂推广应用的关键技术瓶颈。

针对这一挑战，来自西班牙萨拉戈大学的研究团队在《Innovative Food Science》期刊上发表了一项创新研究。Alejandro Berzosa等研究人员开发了一种整合生物工程和物理提取技术的综合方法，通过优化酵母培养条件和采用脉冲电场(Pulsed Electric Fields, PEF)技术，成功实现了从酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中高效生产并提取高纯度GSH。

研究人员采用了几项关键技术方法：首先通过氨基酸补料策略在特定时间点(30小时)添加前体氨基酸来增强酵母细胞内GSH的生物合成；利用脉冲电场技术(PEF)在20 kV/cm场强、150 μs处理时间条件下对酵母细胞进行膜透化处理；使用流式细胞术结合碘化丙啶(PI)染色评估细胞膜透化效率；通过DTNB比色法和UHPLC-MS/MS技术定量分析GSH含量和氧化还原状态(GSH/GSSG比率)；采用DPPH和ABTS自由基清除实验评估提取物的总抗氧化能力；最后在真实的葡萄汁模型中测试提取物防止氧化褐变的功效，并通过SDS-PAGE分析蛋白质组成。

3.1. 通过氨基酸补充增强酿酒酵母的谷胱甘肽生产

研究人员发现，在酵母生长不同阶段添加前体氨基酸对GSH产量有显著影响。过早添加(0或7小时)会因半胱氨酸的细胞毒性而抑制酵母生长，生物量减少30-37%。而在生长后期(24或30小时)添加，则能显著提高细胞内GSH浓度，增幅达53-55%。最终确定在30小时添加10 mM谷氨酸、5.5 mM半胱氨酸和18 mM甘氨酸，并培养至48小时，可获得最高GSH产量(443 ± 7.9 mg/L培养液)，比对照组提高41%。这一策略成功平衡了生物量积累和GSH生产之间的关系。

3.2. 脉冲电场处理酿酒酵母细胞质膜通透性评估

研究表明，电场强度和处理时间是影响细胞膜透化效率的关键因素。10 kV/cm的电场即使延长处理时间也只能使不到26%的酵母细胞发生膜透化。而20 kV/cm处理150 μs(153.3 kJ/kg比能量)可实现99%的膜透化率，且GSH高产菌株与野生型菌株对PEF的敏感性无显著差异。更重要的是，研究发现当比能量输入相同时，不同电场强度可实现相似的透化效果，这一发现为工业放大提供了灵活性。

3.3. PEF-GSH提取物的表征：谷胱甘肽浓度和总抗氧化能力

通过PEF处理并在25°C孵育1小时后，成功从酵母细胞中回收了66%的细胞内GSH。冻干提取物中的GSH浓度达到51.2 ± 1.32 mg/g，GSH/GSSG比率为19.2，远高于OIV对灭活酵母制剂的标准(GSH/GSSG > 3)。抗氧化能力测定显示，ABTS法的TEAC值(90.8 ± 1.2 mg TEAC/g)显著高于DPPH法(11.1 ± 0.8 mg TEAC/g)，反映了GSH的亲水性特性。

3.4. PEF-GSH提取物在白葡萄汁中的抗氧化评估

在葡萄汁模型中，PEF-GSH提取物表现出优异的抗褐变能力。在强制氧化条件(25°C)下，高浓度PEF-GSH提取物(4000 mg/L)与高浓度SO₂(20 mg/L)和商业GSH-rich灭活酵母产品效果相当。更重要的是，PEF-GSH提取物与SO₂联用表现出协同效应——低剂量SO₂(10 mg/L)与中等剂量PEF-GSH提取物(1000 mg/L)组合即可有效稳定葡萄汁颜色，使SO₂用量减少50%。在模拟酒庄澄清条件(10°C, 12小时)下，这些效果得到进一步证实，且颜色差异(ΔE*_ab)超过3个单位的样品在视觉上可辨别出明显褐变。

特别值得注意的是，尽管PEF-GSH提取物的GSH含量是商业产品的两倍，但两者在葡萄汁中的抗氧化效果无显著差异。研究人员认为这可能是因为灭活酵母中的其他核化合物(如肽和蛋白质)也能与醌类化合物反应，产生类似GSH的抗褐变效果。然而，PEF-GSH提取物具有显著优势：其蛋白质含量比商业产品低40%，且剩余蛋白质主要是低分子量肽(<10 kDa)，而商业产品含有大量高分子量蛋白质，易导致沉淀形成。这种高纯度特性使PEF-GSH提取物更适合在发酵后阶段使用，避免了灭活酵母产品可能引起的浊度问题。

该研究通过结合氨基酸补料和PEF提取技术，成功开发了一种高效生产高纯度GSH-rich酵母提取物的综合工艺。这种提取物不仅具有优异的抗氧化性能和较高的氧化还原稳定性，还能在实际葡萄汁应用中有效防止氧化褐变。与SO₂联用时，可实现亚硫酸盐用量减半，对推动葡萄酒酿造向更天然、更安全的方向发展具有重要意义。

研究的创新之处在于首次将GSH生物合成优化与PEF辅助提取技术相结合，克服了传统热提取法能效低、易导致GSH降解的缺点。PEF技术能够选择性透化细胞膜，释放低分子量化合物(如GSH)，同时保留高分子量蛋白质和细胞残骸，从而获得更高纯度的提取物。这种提取物不仅适用于发酵前阶段，也可能适用于发酵后阶段，扩大了其在葡萄酒酿造中的应用范围。

未来研究可进一步优化PEF参数以提高提取效率，评估GSH提取物在不同类型葡萄汁和葡萄酒中的效果，以及探索其与其他天然抗氧化剂的协同效应。这项技术不仅适用于葡萄酒行业，也可能扩展到其他食品和保健品领域，为开发清洁标签产品提供新思路。

从更广阔的视角看，这项研究代表了食品科技领域的一个重要趋势：通过创新加工技术从天然生物资源中提取高价值功能性成分，替代传统化学添加剂。随着消费者对天然、健康食品需求的不断增长，像PEF这样的非热加工技术将在未来食品工业中发挥越来越重要的作用，为实现更加可持续和健康的食品生产体系提供技术支持。