揭示GLP-1R胞外域在偏向激动中的关键作用：基于饱和突变与人工智能的机制探索

本研究针对GLP-1R偏向激动机制不明的问题，通过饱和突变筛选ECD七个关键位点的126个突变体，发现E68和R121突变可选择性消除β-arrestin招募而保留cAMP信号；结合大语言模型(LLM)分析序列特征与信号输出的关联，为B1类GPCR"双域模型"提供新见解，对开发副作用更小的糖尿病/肥胖治疗药物具有重要指导意义。

　　

在糖尿病与肥胖症治疗领域，胰高血糖素样肽-1受体（GLP-1R）已成为最重要的药物靶点之一。尽管GLP-1R激动剂如司美格鲁肽等药物显示出显著疗效，但其常见的恶心、呕吐等副作用严重影响了患者的用药体验和依从性。越来越多的证据表明，这些副作用与GLP-1R的"偏向激动"现象密切相关——即不同药物可能偏好激活不同的下游信号通路（如cAMP通路或β-arrestin招募通路）。然而，人们对GLP-1R偏向激动的分子机制了解仍然有限，特别是关于受体胞外域（ECD）在这一过程中的作用，更是研究的空白地带。

传统观点认为，B1类G蛋白偶联受体（GPCR）采用"双域"结合模型，其中跨膜域（TMD）被认为是信号偏向调控的关键区域。近年来结构生物学研究提示，ECD在配体识别和受体激活中可能扮演着比想象中更为重要的角色。例如，双激动剂替尔泊肽（Tirzepatide）和偏向性肽Exendin-P5与GLP-1R形成的复合物结构都显示出ECD构象的显著变化，暗示ECD可能参与调控信号偏向性。

为了解决这一科学问题，上海科技大学iHuman研究所的研究团队开展了一项系统性研究，成果发表在《The International Journal of Biochemistry》上。研究人员综合运用了分子生物学、细胞信号转导检测、活细胞成像和大语言模型（LLM）分析等多种技术手段。他们首先通过序列和结构分析确定了GLP-1R ECD中七个关键位点（D67、E68、Y69、Y88、L89、W91和R121），这些位点位于三个保守基序（DXY、YLPW和WRD）中。随后构建了126个单点突变体，在HEK-293T细胞中表达了这些突变受体，并通过流式细胞术检测了它们的细胞表面表达水平。

功能检测方面，研究团队使用GloSensor技术测量了cAMP积累情况，采用增强型BRET（eBRET）系统定量分析了β-arrestin 1和β-arrestin 2的招募动力学，并通过活细胞成像技术直观展示了突变受体在细胞内的信号传导过程。最后，他们利用ESM-2大语言模型提取了所有可能单点突变的序列特征，通过主成分分析（PCA）探究了序列特征与信号输出之间的相关性。

研究结果部分揭示了多个重要发现：

在"ECD关键位点的识别与饱和突变策略"部分，研究人员通过比对胰高血糖素受体家族成员的ECD序列，发现D67、E68、Y69、Y88、L89、W91和R121七个位点在肽结合口袋中形成簇状分布，且大部分位于保守基序中。这些位点与配体的相互作用在以往研究中未被充分探索。

"饱和突变揭示各位点的独特相互作用特征"结果显示，不同位点对突变的耐受性差异显著。D67和Y88的突变几乎完全破坏受体表达和功能，表明这些位点对维持ECD结构完整性至关重要；而L89和W91的突变虽然也降低表达水平，但仍保留部分信号功能，提示这些突变可能主要影响受体合成而非折叠过程。

最为关键的发现体现在"E68和R121突变可调控GLP-1R信号偏向"部分。研究人员发现，E68的电荷反转突变（如E68K和E68R）能够选择性消除β-arrestin招募而保留cAMP信号产生，表现出明显的G_s信号偏向。类似地，R121F和R121H突变也显示类似的偏向性特征。活细胞成像实验进一步证实了这些突变体的信号偏向特性：cAMP信号探针显示 robust且均匀的细胞内信号增加，而β-arrestin 2探针则显示这些突变体几乎不招募β-arrestin 2。

值得注意的是，研究还发现了一些突变对β-arrestin 1和β-arrestin 2招募的不同影响。例如，E68N突变以野生型水平招募β-arrestin 1，但显著降低了β-arrestin 2招募的最大效能。这种亚型选择性偏向可能具有重要的生理意义，因为β-arrestin 1和2在不同组织和器官中的表达分布存在差异。

在"探索使用LLM解读突变与信号偏向关系"部分，研究人员利用ESM-2大语言模型提取了所有可能单点突变的序列特征，并通过PCA分析发现，第一主成分（PC1）与所有三条信号通路的活性呈正相关，而第二主成分（PC2）则与β-arrestin招募更特异性相关。这表明LLM确实能够从蛋白质序列中提取与受体信号特征相关的信息。

研究讨论部分指出，这项研究的创新之处在于采用了饱和突变策略而非传统的丙氨酸扫描，从而能够更全面地解析每个位点的化学性质要求。研究发现，ECD中的特定残基（特别是E68和R121）在调控GLP-1R信号偏向中发挥关键作用。E68_GLP-1R与GLP-1中R36_GLP-1之间的静电相互作用可能是β-arrestin招募的关键决定因素——这一发现与替尔泊肽（在相当于R36的位置上有甘氨酸替代）的偏向性特征相呼应，提示了偏向激动机制的共通性。

此外，研究展示了人工智能方法在解读蛋白质序列-功能关系方面的潜力。大语言模型能够从序列中提取与功能输出相关的特征，为未来开发GPCR信号预测模型奠定了基础。随着高质量功能数据的大量积累，有望开发出能够精确预测特定GPCR信号输出的专用模型，这将对药物研发产生革命性影响。

总之，这项研究揭示了GLP-1R ECD在信号偏向调控中的重要作用，完善了B1类GPCR的"双域"结合模型，为理解GPCR信号传导的分子机制提供了新的视角。研究发现E68和R121等关键残基的突变能够产生G_s偏向的信号特征，这为设计副作用更小、选择性更高的GLP-1R激动剂提供了重要的分子基础。同时，研究展示的饱和突变与人工智能相结合的方法策略，也为未来GPCR功能研究提供了新的思路和方法学参考。